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1、引言 过去的几十年里，生物制药行业在细胞培养fed-batch（补料分批培养）实现高表达方面取得了巨大的进步，形成了一整套完整的工艺开发和生产体系，其因操作相对简单，易于监控和产品检测和放行等特点，绝大多数企业均采用fed-batch作为其药品生产的操作方式。 然而，现在一些公司开始开发连续流工艺培养模式，因为相对于传统的批次和补料批次培养方式，连续灌注培养生产能用更小的设备表达更多的产物，同时还能有效改善产品质量。而且该培养模式中，补料营养成分连续加入，有害代谢产物会及时去除，从而使得细胞在长时间内维持高密度培养和活率。这样不仅让细胞处于平衡稳定状态，表达的产物具备高度一致性，尤其是敏感和不稳定的分子而言，及时持续的从罐体从收获纯化蛋白能最大程度的保证产品的稳定性。所以，当反应体系内表达的是易降解或者半衰期很短的产品时，灌注的优势尤为明显。同时，培养环境的优化、体系的精确稳定控制、细胞培养基的开发以及微膜过滤细胞截留设备的发展也进一步推动了连续灌注工艺的发展。 已经有多个使用灌流工艺进行培养的上市产品，如凝血因子（FVIII产品： Kogenate，拜耳； Refacto，辉瑞；FVII产品：Novoseven，诺和诺德）；Protein C（Xigris，礼莱）以及其他的酶制剂甚至包括一些单抗产品（Reopro和Remicade，强生； Simulect，诺华）。 2、连续灌注培养方式 目前，连续灌注培养方式主要有两种，根据其在截留设备中的流体流动方向分为切向流过滤（Tangential flow filtration，TFF）和交替切向流过滤（Alternative tangential filtration，ATF）。TFF中，细胞液通过泵的蠕动作用形成一个连续的环形流动方向，进入纤维膜后，废液会通过膜排出体系之外，细胞会随着环路重新回到培养体系之内。ATF是目前采用更多的一种方式，其通过隔膜泵的往复吹吸作用，实现罐体内培养液在截留设备中的回路流动，而液体中的代谢废物，如乳酸、铵和一些代谢氨基酸，会通过膜排除体系之外，细胞重新回到罐体。另一方面，新鲜培养基会等量持续加入形成平衡，如表1和图1所示。 表1 ATF和TFF对比 图1 TFF和ATF的结构示意图 3、浓缩分批补料和连续灌注生产 连续灌注培养分为浓缩分批补料和灌注培养两种方式，其主要区别在于截留设备分子量的大小和目的产物的不同，其对比如表2所示。浓缩分批补料的主要目的是在相对短的时间内，通过高细胞密度和活率的维持实现高表达，通常用于表达单克隆单抗这些稳定蛋白的产品，它们不会随着培养时间的增加（20-30天）而出现降解等产品质量方面的问题。对于灌注生产而言，目标蛋白会持续通过截留设备流出到反应体系之外，因此可以保证蛋白持续收获纯化，从而形成不同的“亚批次”，通常用于表达不稳定的融合蛋白和细胞因子这些产品。如表2和图2所示。 表2 浓缩分批补料和连续灌注培养 图2 浓缩分批补料和连续灌注培养 4、连续灌注培养关键点 不同于传统的fed-batch培养定量加入浓缩补料，连续灌注培养需要精确的反应体系控制，使之达到相对平衡的状态，因此在实际工艺开发过程中，有诸多关键点需要解决，如表3。 表3 连续灌注培养关键点 从工艺角度看，30-60天（甚至更多）的培养需要更稳定的细胞株，因此在早期克隆筛选中就需要考察细胞株的稳定性（生长、表达、基因拷贝数，以及产品质量等方面），而不是在建立相应细胞库之后再做考察，否则会因为细胞株自身的不稳定造成质量的一致性问题。连续灌注培养要求新鲜培养基的持续加入，因此培养基配制和储存中的稳定性尤为重要，因为其会直接影响到营养物质浓度的成分是否一致稳定。从另一个角度，由于新鲜培养基的加入量通常为1-2vvd（每天加入的培养基体积），培养结束可高达30-120个体积，所以培养基成分的优化必将能极大的缩减成本。同时补料、去除和过滤速率均会影响到反应体系内的营养物质是否处于相对平衡状态。另外，如何在设备极限传质和混合条件下实现高密度细胞的连续稳定培养液非常重要，实际工艺开发中需要摸索和调整目标与控制条件的平衡。类似传统的fed-batch培养，工艺参数的优化也必不可少，其会影响到细胞活率的长期维持状态和蛋白质量的一致性，例如降低温度以维持活率以降低高密度状态下对营养成分的过度消耗。 从对培养环境的硬件要求来看，反应器需要在长时间的培养中维持极高的精确度和稳定性，通气盘的设计要能满足细胞高氧传质系数的要求，又能及时的去除大量累积的CO2。目前，sparger（通气盘）的设计主要分为macrosparger（大泡鼓泡通气）和microsparger（微泡鼓泡通气），或者通气盘将两者结合。Macrosparger的孔径一般为0.5-1.0mm，microsparger的孔径一般为10-20um和200-250um两种，macrosparger由于产生的气泡直径较大，比表面积更小，所以KLa（传质系数）相对较低，虽然提高通气量可以一定程度上提高KLa，但是效果有限，而且会对尾气出气造成潜在威胁，因此macrosparger孔径以及孔的分布非常重要，它直径影响到细胞代谢产生的CO2能否及时的从液体进入气泡而随着上升带出反应体系，而不造成过高pCO2（CO2分压）。从O2的传质来看，较小孔径的microsparger能达到相对较高的KLa（>25h-1），但是过小的气泡在上升过程中会裹挟大量细胞，当达到顶层气液表面后爆炸，此时产生的冲击力将极大降低细胞活率。因此，并不是产生气泡越小的microsparger越有利，虽然它能改善因高密度细胞带来的传质需求，但我们得同时考虑到其表面气速过高时对细胞的损伤。同样，无论macrosparger还是microsparger，它们的传质效果与搅拌也关系密切。传统细胞培养工艺认为，哺乳动物细胞耐受搅拌剪切力的能力有限，通常使用三叶斜叶作为首选，但是随着人们对细胞尤其是CHO（中国仓鼠卵巢细胞）的深入研究和驯化，现在一些细胞已经能忍受相对较高的剪切力，所以一些情况下可考虑加入一个用于微生物培养的6叶桨，增加混合效果的同时也能提高传质效果，从另一个角度看，也能降低反应体系通气量的需求。细胞在相对高密度时比其低密度时对同样转速的剪切力耐受力更强，所以这不失为一个选择的方案。 高密度下大量鼓泡气体的进入势必会对培养体系的尾气提出更高的挑战，尤其是对于一次性反应器而言，培养袋的耐压能力和尾气高通量非常重要，加配备用尾气加热和冷凝回流装置将有效避免尾气堵塞的风险。大规模培养时，使尾气在进入滤器之前充分加热气化然后进入，这样能避免因为气体中夹带的液体堵塞尾气疏水性滤器，配置备份加热套和滤器也应考虑在内。同样，反应器的搅拌混合和方式与整体气体策略，以及尾气出气效率息息相关，能在保证低剪切力的前提下，最大程度的提高混合和传质效果，能减少因高密度培养袋来的极高通气需求，进一步降低对尾气压力的挑战。因此，从这个层面上来看，细胞的培养环境在实际连续灌注培养中需要重点关注。 从系统控制角度来看，精确的反馈信号控制同样不可忽视。目前，大多数在小试阶段采用的仍然是定量补料和定量收获，从而保持反应体系的稳定。由于玻璃罐体规模较小，这种相对粗放的方式容易控制，所以仍是可接受的一种方案。但是对于更大规模，比如百升甚至千升以上的反应器而言，这样简单的控制就显得力不从心，做到绝对的等量补料和去除体积受到各种因素影响，因此精确而及时的反馈控制非常有必要。以反应器的重量或者补料重量作为控制补料和去除体积的重量反馈控制指标，可以有效控制反应的稳定性，使其处于相对平衡的状态，降低了因其他不可控因素造成的补料和收获量的不一致进而引发的安全性问题。其控制方案如下所示。所以，从工艺开发放大的角度看，及时简单的工艺手段能够完成小试阶段开发的需求，但是仍需要掌握更精准的反馈控制以提高放大的成功率。 图3 连续灌注反应器控制方式 Fed-batch中经常使用葡萄糖浓度作为工艺开发中补料加入的基准参数，除了氨基酸、脂类和维生素等，葡萄糖对细胞生长和表达有着非比寻常的作用，它既是细胞能量代谢的来源，其代谢中间体也是糖基化作用的重要底物，所以葡萄糖浓度的平衡控制对最终产物质量十分重要。从另一个角度看，如以葡萄糖浓度作为补料速率的indicator（指针），那必定将极大提高补料量的有效性，避免实际情况中因担心营养成分不够而造成的过量补料，实现精准控制，降低培养基的成本。另外，细胞达到PVCD（Peak viable cell density，最高活细胞密度）之后，设备的稳定运行面临着极大的挑战，如何使细胞维持较高的密度，又能保持相对可以接受的活率是工艺开发中需要解决的问题。如数据记录软件能实时收集运行系统中的活细胞量，而不是传统的离线取样计数，那么据此可构建补料或者去除细胞液的控制回路，将过量细胞及时从系统排除，同时维持设备极限下所能维持的最高密度，必将发挥灌注培养的最大优势。 从数据的收集和控制来看，长时间的培养必然会产生大量的数据，如果只是简单的跟踪几个常见工艺控制数据，可能会导致对培养工艺理解的偏差。因此，全面、准确而及时的实时捕获培养过程中的所有数据十分重要。工艺优化是一个持续改善的过程，我们需要对每个批次培养中的数据做一个全面分析，采用MVDA（Multivariate analysis，多变量分析）的方法找出各数据之间的深层次逻辑联系和其对目标的影响，然后结合DoE（Design of experiment，实验设计）的方法寻求稳定可操作空间，使培养体系真实、稳定、可靠。除此之外，对于批次运行后的数据处理同样不可忽视，传统方法将表达量或质量等结果与某一因素单一对应进行考察，但实际情况往往比这要更复杂，一个结果的出现由多种因素共同作用，所以需要对批次后数据进行MVDA，找出多个变量如何影响最终结果，据此作出判断优化工艺生产。 截留设备与反应系统的连接方式有很多种，对于玻璃罐而言，常见使用从顶盖的diptube深入发酵液，与ATF或TFF构成回路，对于不锈钢或者一次性反应器而言，包括T/C卡盘、无菌快接头、OPTA无菌接头以及无菌焊接等。根据截留设备大小的不同，选择相应尺寸，同时细胞在管路中受到的剪切力以及连接处的压力承受能力都需要注意，有时会加上多个管路回路或者截留设备以降低细胞受到的剪切力和提高截留能力。 5、总结 连续连培养作为一种新型技术极大的拓展了人们对工艺生产方式的理解，它解决了因蛋白质量不稳定或者表达量偏低，以及fed-batch无法保证批次稳定控制等一系列问题，而且去除了中间一些不必要的放大步骤，简化了生产工艺。从法规层面来看，FDA成立Emerging Technology Team（应对新型技术团队）对连续连生产持开放和支持的态度，他们认定连续灌注是一项能带来稳定和更高效生产的技术。同时，由于其丰富的产品线，国内一些大的生物制药企业考也开始尝试从传统的fed-batch向连续生产转变，以期解决传统培养工艺无法真正满足需求的问题。但与此同时，其特定的培养模式也面临着一些挑战，比如如何在长时间的培养中防止染菌，验证从收获到纯化得到的各“亚批次”之间的一致性等，这些问题在企业快速申请IND时会显得尤为重要。上述讨论的工艺开发中的关键点看似相互分离，但实则牵一发而动全身，实际过程中切不可只考虑到某一因素对结果的影响，而应采用多变量分析的方法充分考虑不同变量之间的关系，以及综合效应对产物表达和质量的影响。因此，要想实现连续生产还需要投入更多的时间和精力，才能将上游和下游真正的融合为一个整体，实现高质量蛋白稳定均一的表达和生产。 参考文献
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