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虽然连续生产工艺强化已成功地应用于化学工业生产中，但生物制药工业主要采用分批补料培养（fed-batch），而不是采用连续或灌注法来从中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中制备稳定的单克隆抗体(mAbs)。传统的分批补料培养反应器从接种~0.5×106细胞/mL的活细胞密度(VCD)开始。而后通过引入灌注法或在种子步骤(N-1步骤)强化工艺，这两种方法缩短了细胞培养的时间，增加了产量，分批补料反应器(简称N级反应器)中的活细胞密度VCD能够达到2-10×106 细胞/ mL。在本研究中，我们报道了在3个CHO GS细胞中分别表达3种单克隆抗体，通过增加初始接种VCD，在分批补料生产反应器中连续培养14后可以明显提高最终产量。我们也报道了在补料培养或富集培养基培养的N-1步骤时，采用其他非灌注方法同样可以获得比较高的约22-34×106细胞/mL的最终VCD。这些非灌注 N-1种子可以支持后续分批补料生产反应器约3-6×106细胞/mL的接种密度，并且可以达到与接种灌注N-1种子的5L甚至规模高达500L和1000L的N级生物反应器类似的产量和质量。批生产的N-1步骤中需要注意的是，不管在N-1步还是在后续的强化中基础培养基的富集都是至关重要的。在操作过开发、表征和大规模商业生产方面，这里报道的非灌注N-1方法相对于灌注N-1种子来说，是一种更简单的选择。灌注N-1种子需要灌注设备，以及制备和存储容器来容纳大量灌注介质。虽然本研究中只有3种CHO细胞培养生产的mAbs，但其中采用的非灌注N-1方法来缩短种子培养和培养时间，提高产量的原理适用于任何大规模工业生产生物制剂中由其他不同的哺乳动物细胞产生的不同蛋白。 在化学工业中，工艺强化被定义为开发新设备、技术或方法，改进制造工艺、大幅度减少设备体积、能源消耗和废物形成，并最终形成更便宜、更安全和可持续的技术。在传统的化学工业中，工艺强化已经使用了几十年，采用连续操作的方法来提高工艺产量、产品价值和减少设施占地。然而，在更年轻、更有活力的生物技术行业，实施连续操作面临着更多的挑战。基于所使用的宿主细胞，生物技术过程要么是微生物发酵要么是哺乳动物细胞培养。在某些情况下，包括生物乙醇等大宗化学品的微生物发酵在内的连续操作已取得进展。但在在商业生产设施中实现哺乳动物细胞培养的连续操作或灌注并没有那么快，这主要是由于较小的加工能力、较高的产品价值、复杂的质量标准、对单克隆抗体(mAbs)等生物制药产品的监管要求严格。与微生物发酵相比，哺乳动物发酵系统由于生长速度较慢、培养基复杂和工艺参数控制较难操作。尽管如此，在过去的30年里，哺乳动物的补料细胞培养包括过程强化已经取得了实质性的进展。自20世纪80年代以来，通过细胞系工程、培养基开发和过程控制改进，使产量从几十mg/L提高到2010年代的约3 g/L，实现了更高的比产率(QP)、增加了活细胞密度(VCD)，并延长了生产时间。目前哺乳动物细胞分批补料培养尚未完全成熟，但最近偶尔有大于10 g/L滴度的产量报道，这表明未来使用分批补料操作仍有进一步降低成本的潜力。 在20世纪80年代初，灌注细胞培养实现了高VCD以提高重组蛋白产量的优势。灌注细胞培养需要不断添加等量的新鲜培养基，同时去除废培养基，使用灌注设备如交替切向流动(ATF)设备、交叉流动过滤器、离心机或沉降器而将细胞保留在生物反应器中。因此，与10-20天的分批补料生产培养基相比，在长达数月的时间内可以获得更高的VCD和产量。灌注生产细胞培养已成功地用于生产细胞或病毒，并制造一些低滴度或不稳定的蛋白质和酶。除了单纯灌注外，还研究了灌注与分批补料生产培养的不同混合模式，包括细胞生长早期灌注培养的浓缩补料分批培养、细胞生长早期灌注培养的混合补料分批培养和蛋白质生产晚期灌注培养的混合补料分批培养。 虽然有很多公司一直在致力于灌注生产工艺的开发，但只有一些公司，如勃林格殷格翰、Genzyme、拜耳等，将灌注作为稳定单克隆抗体生产的平台，而武田、药明生物等则根据不同的单克隆抗体产品，同时使用补料培养和灌注。反应器中灌注细胞培养由于工艺控制复杂、灌注体积大、工艺开发和工艺表征面临挑战，尚未广泛应用于稳定蛋白产品的制备。从实验室到商业规模，补料培养工艺已经建立了最高可达25000L的产量，而灌注工艺通常可达10000L。虽然灌注模式比相同规模的补料培养生产效率更高，生产产量也更高，但在规模大得多的商用生物反应器中，补料培养产量比灌注方式高。本文报道了商业生产中两个因产品需求量大而将灌注生产改回补料生产的案例。 与上面讨论的灌注技术在生产反应器(N)中的应用相比，灌注培养技术在种子反应器(N-1)中的应用最近引起了人们的兴趣。N – 1步的灌注策略允许种子细胞在这最后的步骤“集约化”生长来实现更高的VCD，最终可达到15 - 100×106细胞/mL，这远高于传统的N – 1种子培养所能达到的产量，通常< 5×106细胞/mL。与传统的~ 0.5×106 / mL接种密度相比,这允许在反应器接种更高的密度2-10×106细胞/mL，可以减少13-43%的指数增长阶段和整体生产时间而不影响最终的产量和质量，从而提高设备产出(表1)。N-1步引入灌注技术是近二十年来种子培养取得的重大进展。据我们所知，如果没有灌注技术在N-1步的应用，目前还没有2×106细胞/mL如此高接种密度的补料培养反应器的方法报道。 这里，我们的研究提出一种强化工艺，在fed-batch生产过程中，N-1步不使用灌注方法，从而达到较高产量 (高接种密度)的工业友好细胞培养制造工艺。在我们的研究中，通过在N-1步培养加上培养基富集或引入fed-batch操作，可以达到较高的VCD 22-34×106细胞/mL。我们证明，这种fed-batch强化工艺，在N-1步采用非灌注方法来替代灌注法，两者最终可得到类似的产量和质量。采用这些富集N-1batch 和 fed- batch 策略，可以不需要灌注设备和额外的设备以实现最终高VCD。在生产3种不同的单抗工艺中，成功地扩大到500L或1000L反应器。在传统fed-batch过程中，接种密度是一个经常被忽视的问题。大多数的研究集中在一个狭窄的范围(0.25 - 1×106细胞/mL)。我们这一工作也突出了探索N级生物反应器更高、更宽接种密度范围的价值。 本研究利用CHO K1 GS三个细胞株(分别为A、B、C细胞株)表达3个人特异性单克隆抗体(IgG4 mAb1、IgG1 mAb2、IgG1 mAb3)。使用了的工业成熟的种子、培养基和补料培养基(表3)，其中OptiCHO (Cat# 12681011)购自Thermo Fisher。所有3个细胞系均使用含有BM培养基的摇瓶(康宁生命科学)进行解冻和种子扩大(表3)，并在标准条件为36.5℃、5% CO2和150 rpm的培养箱(Climo-Shaker, Kuhner)中培养。在N-1种子接种前，细胞每3-4天传代一次。 使用上述培养箱条件，在初始培养体积为80-100 ml的250 ml摇瓶中或初始体积为1000 ml的2L摇瓶中培养批次和补料批次N-1种子细胞。采用OptiCHO、BM和EBM三种不同的培养基(表3)不含补料被用于评价批次种子培养。fed-batch N-1在BM培养基中生长，从第3天开始每日添加补料，每个细胞系的初始添加量为3%，如表3所示。 灌流N-1种子培养于10L细胞袋中，初始培养体积为5升。摇摆速度控制在28转/分，摇摆角度7°。第0天和1天时，二氧化碳控制在4%，然后关闭。0.2 μm过滤器过滤培养基,保留细胞。连续添加新鲜BM培养基，以相同的灌注速率连续排出废培养基，灌注速率为:第2天至第4天0.5倍培养液体积(VVD)，第4天至第5天1.0倍培养液体积(VVD)，第5天至第6天2.0倍培养液体积(VVD)。 采用96台50 ml 生物反应器进行高通量筛选，研究接种密度对3个CHO细胞株(每个细胞株32个条件) fed-batch培养产量的影响。实验设计为SAS JMP Version 13中生成的3×3×3×3 i -最优自定义DOE。主要影响，二阶多项式，以及所有的相互作用是作为设计的主要模型项。筛选的因素包括接种密度(0.5、3或6×106 细胞/mL)、基础培养基与补料培养基的富集水平(添加0%、8%或16%的补料)、第一次添加日(第1、2或3天)、每日补料量(3.1%、3.6%或4.1%的初始培养体积)。所有TubeSpin®生物反应器使用18毫升初始工作容积，转速300 rpm，36.5ºC和6%的二氧化碳培养箱中培养。除另有规定，补料生产反应器一般使用5L容器进行，初始工作容积为3.3升，持续14天。采用不同培养方法制备的N-1种子进行生产培养。对于A细胞系,强化补料培养是以5×106个细胞/毫升接种在5L生物反应器来比较不同的N - 1种子(图3),而3×106个细胞/mL接种密度被用于1000L反应器和5L反应器中(图6)。从第二天开始添加初始培养体积的3.5%的补料培养基。用1M Na2CO3和CO2将溶解氧(DO)维持在40%，pH值控制在7.2。温度最初维持在36.5℃，第4天转为34℃。B细胞株以3×106细胞/mL接种培养，从第2天开始添加初始培养体积3.1%的补料培养基。DO维持在40%，pH值控制在7.15。在整个14天的培养过程中，温度保持在36.5℃。C细胞株以6×106细胞/mL接种培养，从第2天开始按计划添加可变剂量的补料培养基，第2天至第10天添加量为初始培养体积的5%，第11天至第13天培养量为初始培养体积的3.3%。DO维持在40%，pH值控制在7.05。最初温度维持在36.5°C,第6天时调节到33°C。 XDR一次性反应器扩大培养A细胞珠(1000L XDR,富集N - 1种子),B细胞珠(500L XDR,富集n - 1种子),和C细胞珠(500L XDR, fed batch N - 1种子)。所有非灌注N-1种子均在200L XDR一次性反应器中培养。 细胞培分析用的仪器有pHOx分析仪、v - cell和CEDEX Bio HT。上清样品1000 g离心5分钟后进行蛋白A效价测定。首先用蛋白A层析法对上清样品进行纯化，然后对纯化后的样品进行杂质、电荷变异和N聚糖分析。采用生物pHOx分析仪(Nova Biomedical)检测脱机pH、pCO2和pO2。使用v细胞XR自动细胞计数器(Beckman Coulter)离线定量VCD和细胞存活率。葡萄糖、谷氨酰胺、谷氨酸、乳酸和氨用CEDEX生物HT分析仪(Roche)进行定量。用蛋白A UPLC测定单抗效价。然后，相对于本研究中所有3个CHO细胞株达到的最大最终效价，将其归一化。 使用Tosoh TSK G3000SWxl,7.8 x 30cm,5um, 对杂质进行纯化。高效液相色谱系统280nm梯度监测(Milford,MA),配有温度控制和2996 PDA检测。 电荷变化用毛细管等电点聚焦成像来检测,将样品与适当的pI标记物、两性电解质和尿素混合，然后注入涂有氟碳涂层的毛细管筒。施加高电压后，带电变体迁移到相应的pI。280nm紫外照射，拍摄照片。确定主峰，并对迁移到酸性范围和碱性范围的峰进行求和、定量，并以相对百分面积的形式报告。 使用Prozyme, GlykoPrep®Rapid N-Glycan 和 2-AB (Hayward, CA)的商用试剂盒进行N-Glycan分析。使用Acquity UPLC Glycan BEH Amide, 130 Å, 1.7 µm, 2.1×10 mm column (Milford, MA)配有温度控制和荧光检测器的液相色谱进行低聚糖分析。 为了研究不同接种密度和其他细胞培养参数对最终产量的影响，首次设计了实验(DOE)在96个50 -毫升TubeSpin®生物反应器中，由Tecan液体处理程序自动加样和补料添加，fed-batch培养评估3种不同的CHO K1 GS细胞系细胞表达3种mAbs。TubeSpin®生物反应器的高通量筛选已被用作一个规模缩小的模型，有效地为细胞培养基的发展和产量提高测试了许多不同的条件。在本TubeSpin®试验中，筛选的因素包括接种密度、基础培养基富集水平、第一次添加补料的天数以及补料量占每日初始工作体积的百分比。接种密度对所有3个细胞株的最终产量贡献最大，如柱状图所示A细胞株(图1:A-1)、B细胞株(图1:B-1)和C细胞株(图1:C-1)。在最佳条件下，接种密度由0.5×106增加到6×106 细胞/mL时，A细胞产量增加3倍以上。在较高的接种密度条件下，B和C细胞的表现类似，产量分别增加了1.7倍和2.3倍。 虽然基础培养基富集水平、第一次添加补料的天数以及补料量占每日初始工作体积的百分比并没有提高产量(数据未显示)，但接种密度与这3个参数之间均存在显著的交互作用(图1:A-2至A-4、B-2至B-4、C-2至C-4)。接种密度和基础培养基富集水平之间的作用对所有3个细胞系的最终产量贡献最大(图1:A-2、B-2和C-2)。基础培养基富集的重要性在于，补料添加时间不能早于第0天，最大补料添加量不能超过容器工作体积。基础培养基的富集是充分发挥高接种密度fed-batch培养效益的关键。补料日添加量(补料量百分比)和接种密度的互相作用对A(图1:A-4)、C细胞株(图1:C-4)有显著影响，但对B细胞株无明显影响(数据未显示)。除了2个水平的相互作用外，在B细胞株中显示，接种密度、基础培养基富集水平和补料添加日之间存在3个水平的显著相互作用(图1:B-4)，这使得细胞培养优化更具挑战性。综上所述，我们得出结论，将接种密度从常规的0.5×106细胞/mL提高到6×106细胞/mL，可以显著提高3个单抗14天fed-batch培养的最终产量。 对于接种密度为0.5×106细胞/mL的fed-batch培养，传统的反应器最终能达到的VCD约为2-5×106细胞/mL。然而，使用高接种密度(强化)的fed-batch培养在N-1种子培养阶段需要更大的细胞量。据我们所知，只有接种密度≥2×106 细胞/mL，灌注的N-1种子才能最终获得VCD > 15×106细胞/mL的细胞密度。为了评估N-1种子培养的非灌注方案是否能获得同样高的VCD, 我们将3种非灌注N-1种子培养策略，命名为conventional batch, enriched batch 和 fed-batch与灌注N– 1培养进行了比较(图2和表2)。 第一个实验研究了3 种CHOK1 GS细胞系(2×106细胞/mL初始接种密度) 分别使用3种不同培养基下N- 1种子培养阶段的生长模式 (图2和表2)。3批种子培养基分别是OptiCHO, batch seed medium (BM)和enriched-batch seed medium (EBM) (表3)。相对营养水平,浓缩氨基酸、维生素、葡萄糖、以及渗透压按OptiCHO < BM < EBM的顺序增加，如表3所示。尽管不同的细胞系生长存在差异，细胞的峰值VCD同营养成分的顺序一样增加OptiCHO < BM < EBM (表3)。使用OptiCHO培养基的所有的细胞系在第6天时VCD显著降低 (6-13×106细胞/mL)，活率下降到73 - 86% (图2 b中,2 d和2 f),这对强化的fed-batch培养是不够的。BM培养基条件下生长的VCD峰值为15-26×106细胞/mL，但A细胞株的VCD(图2A)和细胞活率(图2B)从第5-7天显著下降，B和C细胞株的VCD和细胞活率从第4-6天显著下降(图2C - 2F)。VCD和活率的快速下降对于商业生产中强化N-1培养方法的实施构成了风险。最佳结果来自于EBM培养基，在6-7天的培养时间内，VCD达到23-32×106 细胞/mL的峰值，且存活率较高(图2和表2)，因此选择EBM作为强化fed-batch生产的N-1培养基。一种强化良好的培养基对于N-1种子培养达到并保持较高的最终VCD以及稳定的高活率是非常重要的。然而，需要注意的是，在N-1种子培养阶段，过多的营养物质富集可能导致CHO细胞生长抑制(数据未显示)，这是由于较高的渗透压、较高的葡萄糖浓度或其他未知的抑制因素造成的。 除N-1培养外，还对3株细胞株进行了fed-batch培养和灌注N-1培养(表2和图2)， fed-batch N-1培养所用的补料与fed-batch生产培养所用的补料相同。A细胞株fed-batch培养的VCD峰值为22×106细胞/mL，与EBM补料分批培养相似(图2A)。B、C细胞株fed-batch培养的VCD峰值分别为32×106、34×106细胞/mL(图2C、2E)，均略高于EBM分批培养。此外，所有3个细胞系在fed-batch培养方式下整个过程中的存活率都非常好，达到99%(图2)。N-1灌注培养能够维持细胞的指数生长阶段，并得到较高的VCD。正如我们预期的，A、B和C细胞株N-1灌注培养的VCD在第5天显著提高，分别为44×106、41×106和62×106细胞/mL，且存活率达到99%(图2和表2)。 在证明非灌注N-1种子培养获得最终高VCD且具有很好的活率后，我们接下来评估了这些N-1种子培养条件在强化补料分批培养中的表现。A细胞株采用5×106细胞/mL的接种密度来进行fed-batch细胞培养(图3A)。接种灌注N-1种子进行生产培养的VCD峰值为22×106细胞/mL，而接种了enriched-batch 和 fed-batch N-1种子进行生产培养的VCD峰值为17×106细胞/mL (图3A)。然而，所有生产培养基的最终产量相似，范围为0.96-1.00(图3B)。因此，尽管灌注N-1种子达到了较高的VCD峰值，但这并没有显著增加抗体的最终产量。其他代谢物，如葡萄糖、乳酸、铵和二氧化碳，在所有fed-batch培养中都是相似的(数据未显示)。最重要的是，无论N-1种子如何操作，所有fed-batch培养的产品质量属性(包括电荷变体、SEC杂质和n -聚糖谱)都是相似的(图3C)。 图3：5L生物反应器(n=2)中分别接种富集批次、补料批次和灌注n -1种子的A细胞系补料批次生产细胞性能:A、VCD和存活率;B产品效价;C、产品质量属性。 对于B细胞株，使用第五天enriched batch, fed-batch 和 perfusion模式下的N- 1种子，以3×106细胞/mL的接种密度进行生产培养 (图4)。类似于A细胞株，使用灌注N - 1种子fed-batch培养达到了最高VCD,但是不同模式下最终的产量都相似。所有生产培养的最终产量类似，范围为0.33-0.36(图4B)。无论N-1种子的来源是什么，所有生产培养的产品质量也具有可比性(图4C)。 图4：5L生物反应器(n=2)中分别接种富集批次、补料批次和灌注n -1种子的B细胞系补料批次生产细胞性能:A、VCD和存活率;B产品效价;C、产品质量属性。 对于C细胞株，使用第五天fed-batch 和 perfusion模式下的N- 1种子，以6×106细胞/mL的接种密度进行生产培养(图5)。同样，两种模式下培养生产抗体的产量和质量属性相似。 图5：5L生物反应器(n=2)中分别接种富集批次、补料批次和灌注n -1种子的C细胞系补料批次生产细胞性能:A、VCD和存活率;B产品效价;C、产品质量属性。 分别将A和B细胞株的enriched batch N-1种子接种到强化fed-batch培养1000L(图6)和500L的反应器中(图7)，而将C细胞株的fed-batch N-1种子接种到强化fed-batch培养500L的反应器中(图8)。所有3种fed-batch过程在500L或者1000L反应器中表现出很好的生长状态。细胞密度、产量和质量参数与5L反应器中的培养物一致(图6-8)。对于A细胞株，由于其异常高的产量超过了下游纯化的能力，所以在第10天收获了fed-batch培养物。 图8: C细胞株,1000L (n=3)及其附属的5L生物反应器(n=2)中，用富集批次n -1种子接种的分批补料培养细胞属性:A、VCD和存活率;B产品效价;C、产品质量属性。 据我们所知，这是第一个研究了强化(使用高接种VCD)fed-batch培养中，将非灌注N-1种子接种培养与灌注N-1种子接种培养相比较的报告。我们发现，无论是灌注还是非灌注N-1种子，初始接种VCD 为3-6×106个细胞/mL的反应器，在相同的培养时间情况下获得了相似的产量(图3-5)。有报道称，与传统的0.2-0.6×106cells/mL的fed-batch生产工艺相比，采用2-10×106cells/mL的fed-batch生产工艺可以缩短13-43%的培养时间，且产量和质量相当(表1)。我们报告,采用强化的fed-batch培养模式,即以初始接种VCD > 3×106细胞/mL代替传统的0.5×106细胞/mL接种密度，在同样的反应器中培养14天来生产3种mAbs，能够明显提高抗体产量(图1)。因此,在生产反应器中，提高初始VCD可以提高抗体滴度或缩短培养时间进而提高细胞产量。 此外，非灌注N-1种子和灌注N-1种子的最终VCD均比常规N-1种子高得多，可以通过接种相同密度的细胞到较小N级反应器中来缩短种子培养时间。例如，工作体积为3000L，初始接种密度为0.5×106细胞/mL的5000L的反应器中，非灌注N-1富集种子培养，最终VCD为30×106细胞/mL，同样也可以在仅50L工作体积的N-1反应器中接种富集N-1种子来获得同样的VCD。用富集N-1种子的接种比例约为1:67，远远高于传统fed-batch培养的1:5或1:10。在常规的5000L生物反应器生产中，用富集种子代替传统的N-1种子，可以省去至少一个生物反应器。 除了产品效价/产量外，质量属性对细胞培养生产也很重要。我们的研究表明，非灌注种子接种在强化批次补料培养中能达到较好的质量属性，如杂质、电荷变异和N聚糖，与3个mAbs N-1灌注种子条件下的产物特性相似(图3-5)。值得注意的是，这三个质量属性是细胞培养过程中最常见的参数。虽然在富集基础培养基中添加了更多的葡萄糖，但我们在本研究中没有发现非典型糖基化聚集。使用我们这种非灌注强化的fed-batch培养与CHO GS细胞系平台生产多种单克隆抗体和融合蛋白，我们只观察到少数高水平的糖基化(未发表的数据)。我们发现最终的药物中高糖基化水平的发生率较低，说明高糖基化水平与蛋白本身的关系更大，而非强化培养过程。与传统接种细胞密度在0.5×106细胞/mL左右的fed-batch培养相比，非灌注种子接种强化fed-batch培养方式获得更高的VCD(数据未显示)，表明收获时宿主细胞蛋白(HCP)可能更高。由于纯化前HCP值很高，无论接种规模多大我们都没有在收获时测量HCP。尽管如此，无论这3种单克隆抗体和我们许多其他蛋白质的接种细胞密度如何，最终配方药物中的HCP水平是相似的。这说明无论接种细胞密度如何，我们的下游平台工艺都足以去除细胞培养产生的HCP。 采用非灌注N-1方法来替代灌注N-1培养具有优势。如表1所示，灌注N-1种子的最终VCD为13.8 - 40×106cells/mL，需要灌注设备、大量的灌注介质及其储存容器。在这项研究中, 采用非灌注N-1的种子也取得了类似的VCD的22-34×106 cells/mL (表2)。尽管强化fed-batch培养反应器都可以接种灌注或非灌注N-1种子，并且达到等效的产量,但采用非灌注N-1种子培养不需要额外的灌注设备,也不需要大量的灌流设备以及存储设备。由于大型灌注设备和容量的限制，在大型商业生产中运行灌注N-1更具挑战性。Pohlscheidt等报道在3000L范围内灌注N-1最终VCD仅获得13.8×106细胞/mL，而细胞存活率从98%下降到90%(表1)。在随后的400L反应器中，灌注N-1在3000L范围内缩短生产时间仅为13%。根据其他报告，这比实验室规模的生物反应器生产时间减少29% -43%要少得多(表1)。 尽管我们只提供了200 L规模的非灌注N-1种子培养数据来支持支持1000L的临床生产,不管enriched batch还是fed-batch模式，采用非灌注N-1的种子培养的过程开发、工艺表征、验证都比灌注N-1种子培养的更简单。当考虑大规模的商业生产时，例如使用> 3000L N-1种子反应器和> 15000 L生产反应器，这些非灌注N-1策略在成本和操作上的优势变得更加明显。相比之下，无论N-1种子的生产规模如何，非灌注N-1种子与传统N-1种子的操作差异都很小。 N-1培养基的富集对非灌注强化fed-batch培养细胞的生长至关重要。一般情况下，用于解冻和种子扩大的培养基营养物质水平是低的，以达到较高的细胞生长速度。传统的补料分批细胞培养工艺通常采用这种培养基作为基础生产培养基，初始VCD较低，而提高产量的优化主要集中在开发浓缩补料培养基上。本研究中的富集培养基是指在N-1批种子培养基和N级生产基础培养基中添加补料培养基成分，包括葡萄糖、氨基酸等营养成分。CHO细胞的种子和基础培养基的通常保持在260 -320mOsm /kg,而富集培养基可达到370 - 415 mOsm /kg(表3)。我们发现在高接种密度/加强fed-batch培养模式下生产3种不同mAbs，富集培养基与高接种密度之间对提高产量有一个协同效应(图1：a-2, b - 2和c - 2)。此外,我们发现富集N-1种子培养基通过延长N - 1阶段的培养时间从而获得了更高的VCD (图2a,2 c和2e),随后足以支持生产反应器所需的高接种密度 (图3和4)。因此,富集培养基对于非灌注N-1种子以及使用更高接种VCD的强化fed-batch培养来说，都可以达到较高的最终VCD，从而产生更高的效价或缩短反应器培养时间。 综上所述，我们阐明了一种N-1种子培养的非灌注方法，如enriched batch N-1 或者 fed-batch N-1, CHO细胞可以按3-6×106细胞/mL的初始VCD接种到强化fed-batch培养模式。利用非灌注方法的强化fed-batch培养模式与传统的灌注种子培养在细胞培生长、效价和质量上具有类似的水平。据我们所知，在本研究之前，只有灌注N-1策略用于强化补料批次生产。非灌注N-1种子培养策略与灌注N-1种子培养策略相比具有许多优点。本文报道的非灌注N-1方法具有如下优势 :1)易于细胞培养工艺的开发和制造; 2)不需要专门的灌注设备，也不需要准备和储存大量灌注介质; 3)大多数大型商业生产都很熟悉这些操作。在未来的研究中，我们准备在强化补料批量生产培养哺乳动物细胞种进一步优化这种非灌注N-1种子策略，以实现更高的最终VCD。 |
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