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在整个生命周期过程中，上皮组织会保持稳定状态，老的细胞不断死去，干细胞分裂出新的细胞，填补凋亡的细胞。但是你是否思考过，器官或组织如何避免过度生长或者萎缩，这需要细胞丢失和产生之间的严格平衡，但是这种平衡背后的机制并不清楚。
今天分享前天作为封面发表于 Nature 的文章 Feedback regulation of steady-state epithelial turnover and organ size。本文以成年果蝇肠道为研究模型，发现健康的肠上皮细胞可以通过 E-钙粘素（E-cadherin，E-cad）抑制表皮干细胞的分裂，肠上皮细胞的凋亡会打破对干细胞分裂的抑制作用。
在凋亡的表皮细胞中，E-钙粘素丢失，释放钙粘素相关的 β-联蛋白（β-catenin，在果蝇中为 Armadillo）和 p120-联蛋白，进而诱导 rhomboid 的表达；Rhomboid 是一种可对表皮生长因子（EGFs, epidermal growth factors）进行剪切的蛋白酶，并可进一步激活表皮干细胞中的 EGF 受体（Egfr）。阻断表皮细胞的凋亡，E-钙粘素控制的反馈通路会抑制细胞分裂，进而使器官维持相同的细胞数；扰乱这种反馈机制，细胞凋亡和干细胞分裂的平衡被打破，组织会出现增生或者萎缩。本文揭示了成熟细胞凋亡和干细胞分裂间的平衡机制，这种机制精确地调控细胞在何时何地发生置换，解释了器官如何维持固定大小。
初步验证：我们都不是匹诺曹 小的时候，我们都听过匹诺曹的故事。匹诺曹呀匹诺曹，你越是说谎，你的鼻子就越长。但是现实生活中，即使我们说谎了，鼻子也不会变长，这是为什么呢？ 
图 1. 匹诺曹说谎后鼻子会变长，而我们不会
其实不仅仅是鼻子，我们的器官和组织都是这样的。比如手上擦破了一块皮，只需要几天时间就可以长出新的皮肤，而且长好以后就停止生长了，并不会继续长出一个小包包，为什么会这样呢？而肿瘤病人中则完全不同，肿瘤细胞可以无限增殖，长出一个大大的瘤。因此，阐明细胞的这种“适可而止的新老更替”过程不仅仅可以满足“我们为什么不是匹诺曹”的好奇心，也可能加深我们对肿瘤形成机制的理解。 本文主要研究成年果蝇中肠的细胞替代调控。（中肠是指在胚胎学上起源于内胚层的消化管的一部分，向前经前肠至口，向后经后肠达至肛门。在昆虫，中肠也称为胃，与前肠和后肠不同，它没有几丁质内膜，多数情况是在前端附有数个叫做胃盲囊的腺性盲管。） 
图 2. 果蝇肠道的荧光共聚焦图（上）和组织学切片图（下）。绿色表示刷状边缘，蓝色表示细胞核，红色表示内脏肌。（Cell Rep. 3, 1725-38, 2013）
图 3. 成年果蝇中肠的结构
果蝇的中肠分为很多区域，本文研究的是 R4ab 区域。干细胞和肠上皮细胞（enteroblast cells）会表达 Snail 家族转录因子 escargot(esg)。干细胞通常采用不对称分裂，产生具有吸收能力的肠上皮细胞；在少数情况下，会产生具有分泌能力的肠内分泌细胞（enteroendocrine cells）。 首先，我们最好奇的问题是，新生细胞和凋亡的老细胞数目是否相等。要检验这一点的前提是区分老细胞凋亡后补充的新生细胞与已经存在的健康细胞，这里引入了 esg(F/O) system。
图 4. esg(F/O) system 区分新补充的细胞和正常细胞 原理大体是这样的：当温度由 18°C上升至 29°C时，会让 GAL80ts(ts 即为 temperature sensitive) 失活，而有利于干细胞和肠上皮细胞特异性的 esgGAL4，进而驱使 UAS-GFP 和 UAS-flp 的表达。Flp 重组酶通过剪切 CD2 “flp-out” 盒进而阻碍 GFP 的表达，并且产生功能性的 actGAL4。一旦产生了 actGAL4，就会激活 UAS-GFP 和 UAS-flp。因此，总的来看，温度升高会使所有由干细胞分裂而来的成熟细胞表达 GFP。 在果蝇中肠 R4ad 区域检测细胞增加和丢失的动态过程，发现 GFP 阳性细胞（GFP+）随着时间推移呈线性增加，4 天以后，R4ab 区域中所有细胞都表达 GFP，但细胞总数保持稳定。 
图 5. 细胞以新易旧，但总数不变
为了进一步研究细胞产生和丢失间的关系，本文设计了一套可以操控成熟表皮细胞，并且同时追踪干细胞分裂的系统。 图 6. 在不同温度下，干细胞和肠上皮细胞的不同表达模式 主要通过结合肠上皮细胞特异性的 mexGAL4，GAL80ts(mexts) 以及干细胞特异性的 split-nlsLacZ 克隆标签。利用这套系统，在肠上皮细胞中表达凋亡抑制因子 p35，评估对干细胞分裂的影响。阻断肠上皮细胞凋亡会导致更少的细胞分裂（更小的克隆），也会阻碍 S 期的进展。这些结果初步说明肠上皮细胞凋亡与干细胞分裂动态地配合以维持固定的细胞数目和器官大小。 E-钙粘素：关键的玩家
这一切究竟是怎么实现的呢？细胞与细胞之间的黏附蛋白 E-钙粘素引起了作者的注意。在小鼠的肠道中，肠上皮细胞的E-钙粘素会抑制干细胞的分裂；在其他上皮细胞中，凋亡过程中 E-钙粘素被半胱天冬酶降解。 在果蝇的中肠中，发现 E-cad::mTomato 从正在凋亡的而且 Sytox+（Sytox 是一种绿色荧光染料，可浸透死细胞，而不能穿透活细胞膜）的肠上皮细胞表面清除，表明凋亡的表皮细胞会丢失 E-cad。
图 7. 凋亡细胞表面的 E-cad 丢失 为了进一步搞清楚 E-cad 是否参与细胞分裂和凋亡的平衡，在细胞凋亡抑制的肠上皮细胞中用 RNAi 敲低 E-cad，通过测量克隆来评估干细胞分裂。肠上皮细胞 E-cad 敲低并不破坏表皮结构或完整性，但是会阻止干细胞分裂的降低，结果细胞总数增加了 70%，组织出现显著的增生。 这些现象对于 E-cad 是特异性的，因为缺失另一种细胞间黏附蛋白 echinoid 并不影响细胞总数。另外，如果一开始就没有凋亡抑制，E-cad 的缺失会导致细胞过多分裂，但是不会增生。E-cad 的过表达会抑制细胞分裂。这些结果揭示在凋亡抑制的肠上皮细胞中，干细胞分裂的自我平衡抑制需要肠上皮细胞的 E-cad。
图 8. 肠上皮细胞 E-cad 是细胞凋亡和分裂平衡中的关键因子 由于 E-cad 作为细胞间的同源二聚体发挥功能，那么上皮细胞的 E-cad 是否也是通过与干细胞的 E-cad 二聚化而发挥功能呢？结果发现对干细胞和肠上皮细胞中 E-cad 的操纵并不改变干细胞分裂的速度（至少对于 4 天的克隆而言）。因此，上皮细胞的 E-cad 并不与干细胞的 E-cad 相互作用，而是通过某种中间机制。 E-cad-Rho-Egfr 通路浮出水面 所谓近朱者赤近墨者黑，既然 E-cad 这么重要，那么与它相关的蛋白也脱不了干系。与 E-cad 相关的通路有哪些呢？比如 Wingless/Wnt、Hippo 信号通路、Jak-Stat 和 Egfr。 为了搞清楚它们是否可以作为肠上皮细胞 E-cad 的下游调控通路，作者研究 E-cad 敲除是否可以诱导通路特异性的靶基因和报告基因，结果发现 E-cad 的敲除并不影响干细胞中的 Wingless 或 Hippo 信号通路的靶基因、Jak-Stat 信号通路组分和 Stat 信号通路。相反，E-cad 的敲低会诱导 Egfr 靶点的激活。鉴于此，目光自然聚焦于干细胞中的 Egfr。
图 9. 肠上皮细胞 E-cad 可抑制干细胞中 Egfr，并维持器官大小。（AG1478 是磷酸化抑制剂，AG1478 的加入可抑制效应激酶 Erk 的二磷酸化，进而阻断干细胞 Egfr 的激活） 肠上皮细胞 E-cad、干细胞 Egfr 和器官大小之间的关系到底怎样呢？在果蝇中肠的干细胞中，内源性的 Erk 的二磷酸化需要 Egfr，因此效应激酶 Erk 的二磷酸化（dpErk）可特异性地指示 Egfr 的激活。结果发现，上皮 E-cad 敲低导致 dpErk+ 干细胞数目的增加（提示 Egfr 的激活），相反过表达 E-cad 会导致 dpErk+ 干细胞数目降低（提示 Egfr 的未激活）。更进一步发现，Egfr 对于在凋亡抑制的肠上皮细胞中敲低 E-cad 所诱导出来的过度分裂和器官增生是必须的。因此，肠上皮细胞 E-cad 通过抑制干细胞 Egfr，介导细胞数目和器官大小的稳态控制。
图 10. dpErk+干细胞（提示干细胞中 Egfr 激活）的空间分布 那么 E-cad 究竟是如何控制干细胞中的 Egfr 的呢？一种可能的机制是 E-cad 与 Egfr 存在直接的相互作用；另一种是涉及中间的信号分子。为了检验这些可能性，作者分离了单个 GFP 标记的，敲低 E-cad 的肠上皮细胞。测定每个肠上皮细胞周围的 dpErk+ 干细胞的空间分布，在一个区域（25um）中发现了很强的 Egfr 激活，在另一个区域（25~50um）中 Egfr 的激活相对较弱，这些结构提示可能存在中间信号分子。 此外还证实，两个肠上皮细胞来源的表皮生长因子 spitz (spi) 和 keren (krn) 对于在凋亡抑制的肠上皮细胞中 E-cad 丢失所导致的器官增生是必须的。然而，spi 和 krn 并不是由 E-cad 敲低而诱导表达出来的；内脏肌的表皮生长因子 vein，是其他表皮生长因子 Star、argos 和 egfr 本身的调控因子，而且同样不受影响。相反，表皮生长因子蛋白酶 rhomboid (rho) 被 E-cad 敲低显著诱导，并且当 E-cad 过表达时则受到抑制。
图 11. E-cad 的敲低可显著诱导蛋白酶 rhomboid (rho) 的表达 Rho 是一种膜内的蛋白酶，可剪切表皮生长因子的前体，有利于其释放并激活 EGFR。研究发现，在肠上皮细胞中 E-cad 可特异性地抑制转录报告基因 rho-lacZ，而 rho 的过表达将导致 dpErk+ 细胞和磷酸-组蛋白 H3+ 细胞增加；相反，rho 敲低会导致 dpErk+ 细胞几乎消失。rho 和 E-cad 的同时敲低会阻碍由 E-cad 单独敲低所导致的 Erk 的过度激活。这些结果说明肠上皮细胞 E-cad 通过抑制 rho，阻断表皮生长因子的分泌，进而抑制干细胞的 Egfr。 进一步验证 E-cad-Rho-Egfr 通路 前面的结果已经暗示了存在 E-cad-Rho-Egfr 通路，接下来进一步检验 E-cad-Rho-Egfr 通路在肠上皮细胞凋亡和干细胞分裂中的功能。好的理论既可验证，也可以预测结果。如果确实存在 E-cad-Rho-Egfr 通路，那么可能会有以下期待的结果：(1) 敲低 E-cad 的凋亡的肠上皮细胞中 rho 表达应该上调；(2) 在凋亡的肠上皮细胞中 E-cad 的缺失是干细胞 Egfr 激活的基础；(3) 对内源性 rho 的操纵可以改变器官的大小。 首先，在正常的细胞周转过程中 rho-lacZ 主要标识凋亡的肠上皮细胞，相比较而言，机体受伤信号 upd3（一种细胞因子，可激活 JAK/STAT 信号通路）很少标注凋亡的肠上皮细胞；upd3 对于 Egfr 的激活可有可无。因此，在健康的肠上皮细胞中 rho 被沉默，但是在凋亡的肠上皮细胞中表达上调。
图 12. Rho 在凋亡的肠上皮细胞中表达上调。（rho 和 Casp3 的免疫荧光图，包含 planar(水平) 和 vertical(垂直) 视野；Caspase3 是细胞凋亡的主要执行者，因此可作为凋亡细胞的 marker） 其次，通过阻断肠上皮细胞的凋亡和检测干细胞 Egfr 激活，Erk 激活的干细胞在凋亡抑制后完全不存在，但在 E-cad 敲低后，它会以 rho 依赖的方式恢复（图13中g-j）。这些结果说明凋亡的肠上皮细胞中 E-cad 的缺失构成了干细胞中 Egfr 激活的基础。
图 13. E-cad-Rho-Egfr 通路验证和细节梳理 （p35 是凋亡抑制因子，可抑制肠上皮细胞的凋亡） 第三，通过操纵肠上皮细胞中 rho 的表达，测定细胞数目和器官大小，发现在凋亡抑制的肠上皮细胞中 rho 的过表达会导致器官的增生；相反，rho 的缺失会造成器官萎缩；在凋亡抑制的肠上皮细胞中，rho 和 E-cad 的同时缺失会阻断增生（见图 13 中 k 图）。这些结果显示，rho 是 E-cad 的下游的一个中心点，可以平衡干细胞分裂和成熟细胞凋亡，进而维持细胞平衡。 最后，E-cad 是如何控制 rho 的表达的呢？作者检测三种由于结合到 E-cad 而阻碍其核定位的转录因子：β-catenin（在果蝇中为 Armadillo，Arm）、p120-catenin(p120) 和 Yap（在果蝇中为 Yorkie,Yki）。其中，Arm 和 p120 对于肠上皮细胞中 E-cad 的敲除诱导的 rho 的表达以及干细胞中 Egfr 的过度激活是必须的，而对 yki 则不是；此外，arm 和 p120 对 E-cad 敲低和凋亡抑制所诱导的器官增生也是必须的；相反，p120 的过表达，而不是激活的 arm，对于 rho 的诱导、Egfr 的过度激活和器官增生是足够的（见图 13中 k 图）。这些结果进一步揭示了 E-cad 通过 p120 和 Arm 控制 rho。
本文揭示了成熟细胞凋亡和干细胞分裂间的平衡机制，这种机制精确地调控细胞在何时何地发生置换，解释了器官如何维持固定大小。虽然本文没有提到跟肿瘤的联系，但可以料想，阐明器官大小的维持机制可以帮助理解肿瘤的发生发展过程。
通讯作者LucyErin O’Brien
本文通讯作者为斯坦福大学的助理教授 Lucy Erin O’Brien。
图 14.通讯作者 LucyErin O’Brien 和一作 Jackson Liang Lucy Erin O’Brien 本科毕业于哈佛大学，2001 年在 UCSF 获得生物医学和细胞生物学博士学位，2005-2009 年在 UC Berkeley 进行博士后训练，2010-2013 年成为 UC Berkeley 的 Staff Research Associate；直到 2013 年，才成为斯坦福大学的助理教授。（这样看来，其实并不是一帆风顺的）。 值得一提的是，这篇 Nature 封面全部的作者只有 4 个人，第一作者为 Jackson Liang（上图右下角），二三作者分别为 Shruthi Balachandra 和 Sang Ngo，之后也就是通讯作者 LucyErin O’Brien 了。
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