(一)、ABC法:(注,下面各种方法,均为手工操作,如没特别说明,均在室温下进行) 1.切片经二甲苯Ⅰ 5分钟。 2.切片经二甲苯Ⅱ 5分钟。 3. 无水酒精Ⅰ 30秒。 4. 无水酒精Ⅱ 30秒。 5. 95%酒精Ⅰ 30秒。 6. 95%酒精Ⅱ 30秒。 7. 90%酒精 30秒。 8.80%酒精 30秒。 9. 70%酒精 30秒。 10.自来水洗。(后面的切片脱蜡至水一般都是1-10) 11.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。 12.水洗。 13.抗原修复。 14.PBS洗3次,1分钟/次。 15.加入血清孵育20分钟。 16.摔干血清,加入一抗60分钟。 17.PBS洗3次,2分钟/次。 18.加入二抗孵育30分钟。 19.PBS洗3次,2分钟/次。 20.加入ABC复合物,孵育30分钟。 21. PBS洗3次,2分钟/次。 22.DAB-H2O2孵育切片5-10分钟。 23.PBS洗,水洗。 24.Harris苏木素染核5-10分钟。 25.水洗,分化,蓝化,脱水,透明并封固。 (二)、LSAB法。(SP法)(Labelled streptavidim biotln) 1.切片脱蜡至水。 2.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。 3.水洗。 4.抗原修复。 5.PBS洗3次,1分钟/次。 6.加入血清孵育10分钟。 7.摔去血清,加入一抗孵育30-60分钟。 8.PBS洗3次,每次2分钟。加入二抗,孵育20分钟。 9.PBS洗3次,每次2分钟。 10.加入SP复合物孵育20-30分钟。 11.PBS洗3次,每次2分钟。 12.DAB-H2O2孵育5-10分钟。 13.PBS洗,水洗。 14.Harris苏木素染核5-10分钟。 15.水洗,分化 ,蓝化,脱水,透明并封固。 (三)真空负压LSAB法 1.切片脱蜡至水。 2. 0.3%H2O2甲醇真空负压处理5min. 3. 水洗。 4.如果需要,可进行抗原修复。 5.PBS洗3次,每次1分钟。 6.加入正常血清真空负压处理5min。 7.摔干血清,加入第一抗体,真空负压处理5分钟。 8. PBS洗3次,每次2分钟。 9. 加入二抗(即连接抗体)真空负压处理5分钟。 10.PBS洗3次,每次2分钟。 11.加入链卵蛋白复合物,真空负压处理 5分钟。 12.PBS洗3次,每次2分钟。 13.DAB-H2O2孵育5-10分钟。 14.PBS洗,水洗。 15.染核,分化,蓝化,脱水,透明并封固。 注:真空负压即将真空干燥中抽成真空。负压达66.7KPa(500mmHg) (四)Envision TM Systems. 1.切片脱蜡至水。 2.0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。 3.水洗。 4.抗原修复。 5.PBS洗3次,每次1分钟。 6.加入一抗体孵育30-60分钟。 7.PBS洗3次,每次2分钟。 8.加入增强剂孵育20-30分钟。 9.PBS洗3次,每次2分钟。 10.加入酶标抗兔/鼠,复合物,孵育20-30分钟。 11.PBS洗3次,每次2分钟。 12.DAB-H2O2孵育5-10分钟。 13.PBS洗,水洗。 14.Harris苏木素染核5-10分钟。 15.水洗,分化,蓝化,脱水,透明并封固。 (五)免疫组化双染色法。(ⅰ) (Ionmuno-Histochemistry double staimimg method) 1.切片脱蜡至水。 2.0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。 3.水洗。 4.抗原修复。 5.PBS洗3次,每次1分钟。 6.加入非免疫性动物血清,孵育10分钟。 7.PBS洗3次,每次2分钟。 8.加入第一抗体孵育60分钟。 9.PBS洗3次,每次2分钟。 10.加入生物素化的第二抗体,孵育10分钟。 11.PBS洗3次,每次2分钟。 12.加入链卵蛋白素过氧化物酶孵育10分钟。 13.PBS洗3次,每次2分钟。 14.加入DAB-H2O2孵育5-10分钟。 15.PBS洗3次,每次2分钟。 16. 加入双染增强液,孵育10分钟。 17. 加入非免疫性动物血清孵育10分钟。 18. PBS洗3次,每次2分钟。 19. 加入选用的第二种抗体孵育60分钟。 20. PBS洗3次,每次2分钟。 21. 加入生物素标记的第二抗体孵育10分钟。 22. PBS洗3次,每次2 分钟。 23. 加入链卵蛋白素碱性磷酸酶孵育10分钟。 24. PBS洗3次,每次2分钟。 25. 加入AEC溶液,孵育5-10分钟。 26. 自来水洗。 27. 苏木素染核5-10分钟。 28. 水性封片。 注:1.第一种复合物也可先用链卵蛋白素碱性磷酸酶。 2.第1次显色也可用BCIP/NBT溶液,颜色为蓝黑色,但应与苏木素鉴别。 (六)、免疫组化的双染色法(ⅱ) (Immuno-histochemistry double staining method) 1.切片脱蜡至水。 2.0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。 3.水洗。 4.抗原修复。 5.PBS洗3次,每次1分钟。 6.加入选用的第一抗体孵育30-60分钟。 7.PBS洗3次,每次2分钟。 8.加入增强剂孵育20-30分钟。 9.PBS洗3次,每次2分钟。 10.加入酶标抗兔/鼠,复合物,孵育 11.PBS洗3次,每次2分钟。 12.加入DAB-H2O2孵育5-10分钟 13.PBS洗3次,每次2分钟。 14.加入选用的第二种抗体孵育60分钟。 15.PBS洗3次,每次2分钟。 16. 加入增强剂孵育20-30分钟。 17. PBS洗3次,每次2分钟。 18. 加入酶标抗兔/鼠碱性磷酸酶复合物孵育20-30分钟。 19.PBS洗3次,每次2分钟。 20.加入AEC溶液孵育5-10分钟。 21.自来水洗。 22.苏木素染核5-10分钟。 23.水性封片。 (七)细胞培养片免疫荧光染色法。 1.将细胞于载片或盖玻片的片子用生理盐水洗几次。 2.纯丙酮固定10分钟。 3.PBS浸洗3次,每次1分钟。 4.加入选用的第一抗体孵育120分钟。 5.PBS洗3次,每次2分钟。 6.加入荧光抗体孵育60分钟以上。 7.PBS法3次,每次2分钟。 8.0.1%伊文氏蓝衬染3分钟。 9.水洗,蒸馏水洗。 10. 水性胶封片或用缓冲甘油封片。 (八)真空负压免疫荧光染色法染细胞培养片。 1. 将细胞爬于载玻片或盖玻片的片子用生理盐水浸洗数次,彻底洗去蛋白液。 2.纯丙酮固定5-10分钟。 3.PBS浸洗3次,每次1分钟。 4.加入选用的第一抗体孵育真空负压处理15分钟。 5.PBS洗3次,每次2分钟。 6.加入荧光抗体孵育真空负压处理15分钟。 7.PBS洗3次,每次2分钟。 8.0.1%伊文氏蓝衬染3分钟。 9.水洗,蒸馏水洗。 10.水性胶封片或用缓冲甘油封片。 作者:网友 点击:4713次 |
|