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经验 | 文献 | 实验 | 工具 | SCI写作 | 国自然 作者：米粒儿 转载请注明：解螺旋·临床医生科研成长平台 本周文献精读秋季班彤同志老师和大家分享神经自噬研究套路。选取文献来自Nature Communications，2016年影响因子12.123。 文章题目：含有TrkB自噬体介导接头蛋白AP-2 参与的回溯运输促进神经元复杂性的发育并阻止神经退行性疾病的发生，由题目可以提取出以下关键词：自噬体，AP-2和神经退行性。 神经元有一个主要的特征，它的旧物质降解和新物质生成都集中在胞体里，在轴突和轴突的末端都没有生成新的物质和降解旧物质能力。轴突的生存主要依赖于各种运输功能，其中回溯运输就是最重要的一类。 本文主要关注AP-2分子在轴突回溯运输中的作用，共提出三个科学假设分别是：（1）轴突末端来源的自噬体和AP-2共运输；（2）AP-2将自噬体和回溯运输分子马达连接起来；（3）敲除AP-2阻止BDNF/TrkB回溯运输，导致神经发育不良。 结果总览 本文数据相对较少，除了最后两幅图图6和图7是敲除小鼠的动物模型之外，图1-图5都是原代培养的神经细胞或者细胞系细胞，而且它每一幅图中都有活体成像实验结果，因此本文是一个典型的用活体成像技术来解析囊泡在活体细胞运输的细胞生物学文章。 首先在figure 1作者证明AP-2和自噬体marker LC3共运输。在Figure 2中作者发现AP-2、LC3和回溯运输分子马达p150/Dynactin存在相互作用，用生化学的方法将AP-2和LC3联系到回溯运输过程中。 Figure 3作者采用knock down方法敲低AP-2，发现AP-2调节自噬体运输。 在之前研究中证明AP-2的主要功能在内吞通路上，而本文图4证明AP-2对自噬体的调节与其在内吞通路上的功能无关。 接着Figure 5中从功能学上证明AP-2对神经形态的建立是必须的。最后两个在体的分别在体内验证实验证明AP-2敲除后对表型和TrkB通路的影响。 本文数据量确实不大，能发到12分左右的杂志主要却决于其清晰的逻辑。下面我们看一下本文的说理逻辑。 数据解析 首先进入图1，图1中作者在原代培养的海马/皮层神经元中用LC3-GFP标记自噬体囊泡，红色荧光标记AP-2μ-mRFP，发现二者不但共定位，而且共运输。 之后作者在图b中采用Kymograph方法，观测囊泡的运动情况。通过以上描述性的数据，说明用AP-2μ-mRFP 红色荧光标记的囊泡的种种运动的特点都符合以前对于自噬体囊泡运动特点的的报道， 比如双方向运输，轴突树突速度类似，且都在0.4-0.5μm/s，属于快速运输。由此推测AP-2标记的囊泡可能是自噬体囊泡。 而图1d-f是图1的关键的探索性数据。依然采用LC3-GFP标记的自噬体和AP-2μ-mRFP 红色荧光标记AP-2分子，发现在轴突上回溯性运输（轴突自噬体的主流方向）明显更活跃，直接证明AP-2囊泡和自噬体的囊泡相关。 图1g-i是定量数据，进一步说明用LC3-GFP标记的自噬体和AP-2μ-mRFP 红色荧光标记的相关性。 一般来说，好的文章不仅仅有定性数据，还要有定量数据。本文作者采用检验两个结构共定位的金标准Pearson’s coefficient，该参数在-1在1只见，1代表两者完全共定位。一般认为大于0.4即可证明二者共定位，本实验中数值在0.6左右。 基于以上实验结果，作者在图1主要证明 AP-2μ 和自噬体囊泡不但共定位，而且共运输。且引出全文使用的两个重要证明两个囊泡结构相关性的方法 （1）Kymograph （2） Pearson’s coefficient。 图2采用比较简单生化实验证明AP-2和自噬体囊泡相互作用，并且证明AP-2作为一个接头蛋白将自噬体囊泡和分子马达联系在一起的。 三个相互作用的分子分别是AP-2 脑中的两个剪切体 αA 和 αC，自噬体蛋白LC3b，P150 Glue（回溯运输的机动蛋白复合物的构成）。采用pull-down和co-ip实验判断三种蛋白相互作用。 虽然本文主要是一篇细胞生物学的文章，但是生化分子的机理还是非常必要的。 图3在简单而必须的生化分析之后，作者提供了更多的细胞生物学数据。发现AP-2的敲除，明显降低了轴突上自噬体（又是LC3-GFP标记的）的运输速度。 接着作者展示电镜结果，如下图所示： 利用电镜可以很容易地发现在AP-2 基因敲除的细胞中，突触末端的具有这种形态的囊泡增多了，这就反向证明了AP-2对于从囊泡末端清除自噬体是非常重要的。 接下来采用活体成像技术发现AP-2 基因敲除的神经元中，轴突中自噬体囊泡和晚期内吞体囊泡（Rab7标记）都明显升高，证明这些本来该被回溯运输运回去并且降解掉的结构出现了明显累积。 在m-n图中，利用一种抑制溶酶体降解的药物（Folimycin）处理，可以将野生型神经元中自噬体囊泡和晚期内吞体囊泡（Rab7标记）的水平升高到 AP-2敲除神经元的水平，证明这些累积就是因为下游降解不畅导致的。 综上所述，在图3中作者通过一系列细胞生物学的方法，证明AP-2 对于从轴突末端来的以降解为目的的囊泡回溯运输是必要的。 图4依然是细胞生物学的分析，这里用到了一个工具RFP-GFP-LC3 融合蛋白，RFP/GFP的比值反映了自噬体成熟度的一个标志。AP-2基因敲除可以明显影响自噬体成熟。
接着作者发现AP-2敲除后，神经元中自噬体的底物P62明显累积（图c-d）。此外，采用不能和LC3相互结合的突变型的AP-2Mut发现和基因敲除的结果类似（图e-f）。E描述自噬体的回溯运输受阻，f描述自噬体的成熟受阻。
以上两个不同的实验都证明了AP-2对自噬体的功能是非常重要的。 下面是图4的最后一组数据，据推断这个实验是审稿人要求加上的，这个数据与整个文章没有必然的联系。 这个实验主要证明在AP-2 基因敲除Hela细胞中，内吞作用会被阻断 （AP-2已知的功能），而过表达AP-2野生型或者突变型都可以逆转AP-2敲除导致的内吞缺陷。
从图5开始，作者用了三幅图的篇幅，试图探讨‘功能’的问题。在图a-d中，作者首先证明 LC3自噬体回溯运输的重要货物是BDNF的受体TrkB。在图c-d中随着BDNF 的加入，可以促进这种自噬体囊泡的回溯运输。 在图E-g中， AP-2基因敲除，可以导致含有被激活的BDNF的受体TrkB （磷酸化TrkB，pTrkB）的囊泡在轴突中累积。
由此，采用内源性的数据，说明AP-2被干扰后，这个重要的神经营养因子BDNF的受体运输不回去了。 紧接着，在体外培养的神经元中，AP-2的敲除 （i）或者突变 （m），或者另一个会影响自噬体成熟的分子ATG5的敲除，都会导致神经元形态变简单，这个和BDNF功能受到影响是一致的。
下边是figure 6，主要展示基因敲除小鼠的表型。 在胚胎期从E13.5开始，特异敲除在神经元中表达的AP-2。老鼠会在出生后21天到26天之后死掉，b就是死亡曲线。 c-h 用高尔基染色的方法，染了这些基因敲除小鼠的脑片，发现明显神经元的复杂性比野生型的窝友要差。
进一步研究中，采用尼氏染色的方法，发现AP-2基因敲除小鼠的一些脑区的发育受到影响。而这些受到影响的区域的细胞中有P62的异常累积。
最后是图7，在这张图中不仅提出了模式图，也增加了和BDNF相关的在体实验结果。在AP-2条件基因敲除小鼠中，BDNF的蛋白水平和mRNA水平都下调（图b-d）。 说明在AP-2敲除后，BDNF通路是显著抑制的。而在e-g中展示在AP-2基因敲除神经元中外加BDNF可以逆转神经元形态简单的表型，而加入神经生长因子NGF不可以，说明BDNF通路特异性。 套路分析 精讲数据结构之后，我们发现本文数据相对简单，但是其实验设计内在逻辑性较强，具有很好的说服性，以本文为例，彤同志老师为大家整理了神经退行性疾病自噬研究相关实验设计思路。 首先自噬细胞模型为培养的大小鼠海马/皮层神经元，观察指标包括LC3染色，E/R/TFP-LC3 活体运输和电镜双层膜囊泡。 采用动力学研究主要是轴突运输受阻，采用细胞模型为培养的大小鼠海马/皮层神经元；观察指标为 TrkB-mRFP, TFP-LC3标记的囊泡运输速度、频率、停顿；分析方法包括Kymograph, Vesicle Tracking (囊泡追踪)。 轴突运输受阻后可能引起自噬降解异常，鉴定主要采用电镜，共聚焦显微镜，标记采用p62聚集，Rab7/LC3; pTrkB/LC3共定位，动物模型为 AP-2α 基因敲除小鼠。 最后需要考虑的问题是神经元形态异常，在这个问题中主要采用细胞模型，包括AP-2 基因敲除、AP-2αMut转染，ATG5转染神经元。观察指标为神经元突起分支数目。而动物模型是AP-2α 基因敲除小鼠。 |
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