分类检测非小细胞肺癌患者外周血中循环肿瘤细胞的临床价值

作者来源

尹寒露 阴建 陈立文 李宁 刘志安 胡志斌 沈洪兵

中华肿瘤杂志,2016,38( 9 ): 677-681.

摘    要

目的 探讨利用上皮细胞黏附分子(EpCAM)分类检测非小细胞肺癌(NSCLC)患者外周血中循环肿瘤细胞(CTCs)的临床意义。

方法 收集47例NSCLC患者的外周血样品各7.5 ml，其中3例患者在每一治疗周期结束时采集外周血样品用于动态监测CTCs。以阴性－磁性法分离和富集CTCs，经EpCAM和CK 7/8免疫荧光染色后，流式细胞仪鉴定CTCs并计数。

结果 47例患者的血液样品中，表达EpCAM的CTCs检出率为48.9%(23/47)，其中Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期患者的检出率分别为64.3%(9/14)、40.0%(4/10)和43.5%(10/23)。不表达EpCAM的CTCs检出率为87.2%(41/47)，其中Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期患者的检出率分别为78.6%(11/14)、90.0%(9/10)和91.3%(21/23)。两类CTCs的总检出率差异有统计学意义(P<0.001)，其中Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ期患者的两类CTCs的检出率差异均无统计学意义(均P>0.05)，而Ⅳ期患者的两类CTCs检出率差异有统计学意义(P＝0.001)。各分期患者外周血中，不表达EpCAM的CTCs数量均明显高于表达EpCAM的CTCs数量(均P<0.05)。Ⅳ期患者中，不表达EpCAM的CTCs>90%患者的比例明显高于Ⅰ～Ⅱ期患者(P＝0.030)，不表达EpCAM的CTCs在50%～90%患者的比例明显低于Ⅰ～Ⅱ期患者(P＝0.001)。不表达EpCAM的CTCs>50%时，患者的治疗普遍无效(P＝0.033)。

结论 EpCAM分类检测CTCs，有助于评估NSCLC患者的远处转移和治疗疗效。

正    文

肺癌的发病率和死亡率已位居各类肿瘤首位，患者的5年相对生存率仅为15%。复发和转移是肺癌患者死亡的主要原因。目前认为，循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)是肿瘤远端转移的关键环节。大量的研究结果显示，CTCs可以作为一个独立的指标预测肿瘤的疾病进展和患者的生存。CTCs在小细胞肺癌中的检出率高达86%。但是绝大部分肺癌患者为非小细胞肺癌(non－small cell lung cancer，NSCLC)，即使在晚期NSCLC患者外周血中，CTCs的检出率也仅为50%左右。其原因可能为目前的研究中普遍使用上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)分离和鉴定CTCs。由于肿瘤细胞在侵袭转移过程中发生上皮间质转化(epithelial－mesenchymal transition，EMT)而丢失细胞表面的EpCAM表达，仅基于EpCAM鉴定CTCs将明显低估CTCs的数量并可能导致错误的临床假设和结论。CTCs的检测应当还包括不表达EpCAM的CTCs。本研究中，我们检测了不同分期NSCLC患者外周血中的CTCs，基于EpCAM对其进行分类并动态监测了治疗过程中各类CTCs的数量变化及其与疗效之间的关系，为进一步拓展CTCs在NSCLC中的临床应用提供信息。本研究经南京医科大学伦理委员会批准。

资料与方法

1.

临床资料：

研究对象为南京市胸科医院和南京市肿瘤医院2012年12月至2013年11月间住院的47例肺癌患者。在患者知情同意的前提下，收集外周血样品各7.5 ml。47例肺癌患者中，男29例，女18例；年龄44～90岁，平均年龄62岁。TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期14例，Ⅲ期10例，Ⅳ期23例。肺腺癌37例，肺鳞癌10例。3例患者在每一治疗周期结束时采集外周血样品，根据世界卫生组织实体瘤疗效评价标准，分为完全缓解、部分缓解、疾病稳定和疾病进展，其中完全缓解和部分缓解为有效，疾病稳定和疾病进展为无效。

2.

主要试剂和实验设备：

人CD45 Depletion试剂盒、人藻红蛋白(phycoerythrin，PE)分选试剂盒购自加拿大Stemcell公司，PE标记的鼠抗人CD53单克隆抗体、异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记的鼠抗人细胞角蛋白7/8(CK7/8)单克隆抗体、FITC标记的鼠抗IgG2a、κ单克隆抗体同型对照及FACS AriaⅢ流式细胞仪购自美国BD公司。别藻蓝蛋白(allophycocyanin，APC)标记的鼠抗人EpCAM单克隆抗体、APC标记的单克隆鼠抗IgG2b、κ同型对照购自美国Biolegend公司。

3.

血液样品的采集：

使用乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)－K2真空抗凝管通过静脉穿刺采集外周血样品7.5 ml。为了避免静脉穿刺导致的内皮细胞和正常上皮细胞的污染，前2 ml血液予以废弃。血液样品采集后4 h内分离CTCs，以保证结果的准确性。

4.

阴性－磁性法分离CTCs：

血液样品使用红细胞裂解液去除红细胞后，用含10%胎牛血清和1 mmol/L EDTA的PBS缓冲液重悬成1×108/ml的细胞悬液，使用人CD45 Depletion试剂盒，按照说明书去除白细胞后，细胞重悬至100 μl，加入5 μl PE标记的鼠抗人CD53单克隆抗体，进行免疫荧光染色，然后使用PE阳性筛选试剂盒，按照试剂盒说明书再一次去除白细胞，最终富集出CTCs。

5.

流式细胞仪检测：

按照文献中介绍的方法进行外周血CTCs的检测。即将富集后的CTCs重悬至200 μl后分成两等份(分别对应3.75 ml血)，1份加入10 μl APC标记的鼠抗人EpCAM单克隆抗体，另外1份加入同样量和浓度的APC标记的鼠抗IgG2b、κ单克隆抗体同型对照。4℃孵育10 min后，PBS洗涤并离心，去除上清液，加入1 ml含1%甲醛的PBS缓冲液，固定细胞，4℃孵育10 min。PBS洗涤后，加入1 ml Hanks平衡盐溶液(含0.1%皂苷和0.05% NaN3)4℃通透细胞5 min，离心去除上清，重悬至100 μl。分别加入10 μl FITC标记的鼠抗人CK7/8单克隆抗体及同样量和浓度的鼠抗IgG2a、κ单克隆抗体同型对照，4℃孵育30 min。PBS洗涤，重悬至300 μl后，经FACS AriaⅢ流式细胞仪鉴定CTCs并计数。

6.

数据分析：

以FlowJo 7.2.5软件分析流式细胞仪的检测结果。CTCs的定义为CK 7/8阳性并且不表达白细胞表面抗原的细胞，包括表达EpCAM的CTCs和不表达EpCAM的CTCs。由于健康志愿者和良性疾病的患者血液中也可能存在CTCs，设定上述两类CTCs的阈值均为1个，以尽可能排除假阳性带来的误差。两类CTCs中只要有一类CTCs的数量>阈值，则规定该血液样品检出CTCs。为了便于统计学描述两类CTCs的数量以及比较两者之间的差异，如果同一份血液样品中两类CTCs的数量均≤阈值，则不纳入统计分析；如果同一份血液样品中仅有一类CTCs数量>阈值时，则另一类<阈值的CTCs的数量记为0，纳入统计分析。

7.

统计学方法：

采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析。非正态分布资料采用中位数(M)和四分位数间距(QR)进行描述。采用Mann－Whitney法和Kruskal－Wallis法比较CTCs的数量分布，率的比较采用χ2检验和Fisher精确检验。检验水准为α＝0.05。

结    果

1．总CTCs的检出率和数量分布：

47例患者的血液样品中，总CTCs的检出率为93.6%(44/47)，其中Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期患者的总CTCs检出率分别为85.7%(12/14)、90.0%(9/10)和100%(23/23)。Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期患者的总CTCs数量分布见表1。

两类CTCs的检出率比较：

47例患者的血液样品中，表达EpCAM的CTCs检出率为48.9%(23/47)，其中Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期患者的检出率分别为64.3%(9/14)、40.0%(4/10)和43.5%(10/23)。不表达EpCAM的CTCs检出率为87.2%(41/47)，其中Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期患者的检出率分别为78.6%(11/14)、90.0%(9/10)和91.3%(21/23)。两类CTCs的总检出率差异有统计学意义(P<0.001)，其中Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ期患者的两类CTCs的检出率差异均无统计学意义(均P>0.05)，而Ⅳ期患者的两类CTCs检出率差异有统计学意义(P＝0.001)。

3．两类CTCs的数量分布比较

44例检出CTCs的患者中，表达EpCAM的CTCs和不表达EpCAM的CTCs在不同分期患者中的数量分布见表1。Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期患者中不表达EpCAM的CTCs数量均明显高于表达EpCAM的CTCs数量(均P<0.05)。

4．不表达EpCAM的CTCs数量占总CTCs的比例与分期的关系：

在44例检出CTCs的Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期患者中，不表达EpCAM的CTCs数量占总CTCs的比例<50%的患者分别有1例(8.3%)、0例(0%)和5例(21.7%)；不表达EpCAM的CTCs数量占总CTCs的比例在50%～90%的患者分别有8例(66.7%)、3例(33.3%)和2例(8.7%)；不表达EpCAM的CTCs数量占总CTCs的比例>90%的患者分别有3例(25.0%)、6例(66.7%)和16例(69.6%)。Ⅳ期患者中，不表达EpCAM的CTCs数量>90%的患者比例明显高于Ⅰ～Ⅱ期患者(P＝0.030)；而不表达EpCAM的CTCs数量在50%～90%的患者比例明显低于Ⅰ～Ⅱ期患者(P＝0.001)。

5．CTCs的动态监测结果：

例1患者在治疗初期病情处于疾病进展期，进行培美曲塞联合卡铂治疗2个周期，疾病稳定后发生进展，在随后的厄洛替尼靶向治疗中，疾病进一步进展并且于1个月后死亡。例2患者在初期疾病进展时进行培美曲塞联合顺铂化疗4个周期，疾病稳定后部分缓解，最终完全缓解。例3患者在初期显示疾病进展，随后进行了4个周期的厄洛替尼治疗，疗效分别为疾病稳定、疾病稳定、疾病进展和疾病稳定。3例患者的治疗疗效、病灶大小以及CTCs数量见表2。14个疗效监测点中，不表达EpCAM的CTCs占总CTCs的比例>50%的监测点有11个，对应的患者疗效均为无效(100%)；不表达EpCAM的CTCs占总CTCs的比例≤50%的检测点有3个，对应的患者疗效仅有1例为无效(33.3%)，差异有统计学意义(P＝0.033)。表明不表达EpCAM的CTCs数量占总CTCs的比例>50%时，患者的治疗普遍无效。

讨    论

CTCs在外周血中的数量极少，检测前需要首先分离和富集CTCs。由于缺乏特异性的标志物，目前的研究主要基于肿瘤细胞表面EpCAM的表达来分离CTCs，并对其进行计数。然而这一方法可能明显低估了CTCs的数量。本研究中，我们基于以前建立的阴性富集法分离CTCs，结果显示，表达EpCAM的CTCs在Ⅳ期NSCLC患者中的检出率为43.5%，这与Cell Search仪器检测的结果一致。此外，CK 7/8阳性CTCs的检出率及数量均远远高于表达EpCAM的CTCs检出率，这一结果与Krebs等报道的结果一致，但高于黄同海等报道的结果。表明在NSCLC患者中，采用不依赖EpCAM的方法对CTCs进行分离和鉴定更可取。

分期是影响NSCLC患者预后的重要因素，但CTCs在NSCLC中的临床诊断价值还没有明确的结论。Krebs等的研究结果显示，表达EpCAM的CTCs数量与NSCLC患者的分期有关。但Wendel等的研究结果却显示无关，与本研究结果一致。这种矛盾的临床结论表明，仅仅基于EpCAM对CTCs简单计数用于NSCLC的临床诊断是有局限性的，因为NSCLC患者的外周血中存在一类不表达EpCAM的CTCs，这类CTCs亚群在目前的临床研究中被排除在外。目前的研究显示，CTCs在肿瘤远处转移中扮演着关键性的角色。本研究结果显示，Ⅳ期患者外周血中不表达EpCAM的CTCs检出率明显高于表达EpCAM的CTCs检出率，然而这一差别在Ⅰ～Ⅲ期患者中并未出现，提示不表达EpCAM的CTCs可能影响NSCLC的远处转移。因此我们在本研究中采用CTCs数量的相对值来反映CTCs的分布。结果显示，Ⅳ期患者中，不表达EpCAM的CTCs>90%患者的比例明显高于Ⅰ～Ⅱ期，这表明不表达EpCAM的CTCs数量在NSCLC患者发生远处转移后占有绝对优势。因此，不表达EpCAM的CTCs>90%可能是一个有价值的指标，用于评估NSCLC患者的远处转移。同时还发现，Ⅳ期患者中，不表达EpCAM的CTCs在50%～90%患者的比例明显低于Ⅰ～Ⅱ期。有研究显示，EMT是肿瘤侵袭和转移的重要机制，并且肿瘤细胞表面的EpCAM表达在EMT过程中将会下调或丢失。因此，不表达EpCAM的CTCs应当包括了发生EMT的CTCs。上述结果可能预示了发生EMT的CTCs在NSCLC早期入血以及远处转移后数量增加。因此，需要对CTCs进行EMT特征鉴定，这将可能进一步阐明肺癌的转移机制，并可能发现一类新的标志物用于肺癌的临床诊断。

为了进一步探讨CTCs及其表型的变化所具有的临床诊断价值，我们对3例患者治疗过程中两种CTCs的数量和相对比例变化进行了动态监测。结果显示，表达与不表达EpCAM的CTCs数量仅仅在治疗有效时呈现出递降趋势，而在治疗无效时呈现出无序变化。这表明CTCs的简单计数用于NSCLC患者的疗效评估是有局限性的。有研究显示，发生EMT的CTCs所占的比例与乳腺癌患者的化疗疗效有关，比例越高，疗效越差。3例患者中，14个监测点的结果显示，不表达EpCAM的CTCs占多数时，患者的治疗疗效普遍不佳。此外，初期治疗有效但不表达EpCAM的CTCs占多数时，患者进一步的治疗也会变得无效。这表明不表达EpCAM的CTCs可能在疗效上起着更为重要的作用。因为不表达EpCAM的CTCs数量越多，发生EMT的肺癌细胞数可能也越多，而EMT的发生能够增强肿瘤细胞的耐药性。需要强调的是，不表达EpCAM的CTCs中也可能存在内皮细胞或非肿瘤细胞等。因此，应进一步探究不表达EpCAM的CTCs的生物学功能及其与疗效之间的关系，从而为优化肺癌的治疗方案提供理论基础。

 总之，分类检测患者外周血中的CTCs可为NSCLC的肿瘤进展及治疗疗效评估提供参考。然而，本研究的样本量较少，在进一步的研究中需要扩大样本量，并需要鉴别不同CTCs的生物学特性及其与远处转移和疗效之间的对应关系，这将为最终确定CTCs在NSCLC中的临床应用价值奠定理论和实践基础。

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