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周彩存简介：上海市肺科医院肿瘤科，在胸部肿瘤领域属于权威大佬。 随着分子生物学的快速发展，“精准医疗”已经成为了肿瘤诊疗新进展中最为热门的词汇之一。液态活检是指运用敏感的血液学检测方法在千万背景血细胞中检测并分析潜在的肿瘤细胞。简而言之，就是通过血液检测代替肿瘤组织检测。随着各种高敏感度检测方法的问题，液态活检如果按其来源可分为循环肿瘤细胞（circulating tumor cel l , CTC）、循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）、小分子R NA（mircoR NA）、长链非编码R NA（long non-coding RNA ）等肿瘤。目前临床常用主要为CTC和ctDNA。 1.1 CTC s的前世今生 1869年，澳大利亚一名叫Thomas Ashworth的内科医生，他通过显微镜观察到一例死于转移瘤患者，其外周血中存在与原发肿瘤相似的细胞，这样的细胞或许能反映原发肿瘤的特性，被称为CTCs。由于检测手段的限制及细胞的稀少，直到2 0世纪9 0年代，CTCs的价值才被内科医生充分认识到。 肿瘤原发灶或者转移灶中，具有转移倾向一类肿瘤细胞，通过EMT等生物学行为，迁移入血称之为CTC。CTC一旦迁徙入血，其存活时间一般较短，通常不会超过 24 h ；而且，就其形态而言，CTC具有高度的异质性。因此，即便通过最温和的分离技术，循环还是经常可以检测出已经凋亡或者破坏的CTC。 1.2 CTCs的生物学特征 一个重要的问题是，早期肿瘤外周循环中是否可以检测到CTC，也就是说CTC迁移入血的过程是发生在肿瘤早期还是晚期？理论上讲，肿瘤大小超过2 mm左右时便可诱导血管生成进入肿瘤，提供血供，从而为肿瘤细胞迁移入血提供基础。Husemann等通过研究证实，在转基因小鼠种植后约17-18周，循环中即可检出CK与H ER同时阳性表达的细胞，而此时原发肿瘤体积还小于1 mm3 另有研究结果也再次印证了上述结果。基于 CTC的生物学特征，理论上而言，在肿瘤发生发展的早期，循环中即可检出CTC。 1.3 CTCs的临床应用 目前对肺癌的诊断和分期主要基于影像学或病理学检查的结果，对于精确反映肿瘤细胞血循环微转移对患者治疗及预后的影响有一定难度，而CTCs检测则可以弥补这一缺陷。肿瘤转移的重要途径是血液系统，判断临床分期的标准之一是是否发生远处转移。研究结果表明，CTCs与肿瘤分期密切相关，对肺癌诊断具有潜在的应用价值。特别值得一提的是，FR靶向 PCR CTC检测技术对I 期NSCLC患者的诊断灵敏度达到67.2%。I I 期、I I I期、I V期NSCLC患者阳性检出率分别为69.4%、80.9%、100% ！！！与一般肿瘤标志物（NSE 、CEA 、CY FR A 211等）相比，基于FR靶向PCR 的CTC检测方法具有更大的曲线下面积（0.823）和约登指数（0.573），且更易去辨别患者是NSCLC还是健康志愿者/肺部良性疾病患者。 由于 CTC可以评估肿瘤的发生发展状态，而且手术切除原发灶后，血液中CTC数量应该为阴性。因此，理论上而言，在术后监测过程中，CTC数量阳性，可能提示肿瘤存在复发的可能性。 CTCs的减少是治疗有效的早期指标。另有一项研究评估了CTC数量波动对化疗疗效的评估作用。研究共检测了25 例转移性肺癌患者接受化疗前和化疗2 个周期后的CTC数量。结果发现，CTC数量的前后变化与影像学表现一致，CTC下降、无变化、上升患者的无进展生存期分别为 2.05 个月、3.25 个月和8.35 个月（P<0.05），提示CTC比一般肿瘤标志物更能反映肿瘤接受化疗后的变化。 如上所述， CTC用于肺癌分子基因诊断的不足之处在于CTC本身的检出率低，但就目前的研究结果来看，一旦外周血中富集出足够量的CTC，其基因检测与组织学对比的一致率较高。 2.1 ct DNA 分析技术 循环肿瘤DNA（ciuculating tumor DNA, ctDNA ）是指肿瘤细胞体细胞DNA经脱落或者当细胞凋亡后释放进入循环系统。由于肿瘤特异性的ct DNA 并不存在于正常细胞中，他们为癌症检测提供了一种十分敏感和特异的方法。 ct DNA 在血液中稳定性有限，因此抽血后，包括cf DNA 的准备步骤在内不能超出数小时。在 2015 年欧洲肺癌年会公布的IGN ITE 研究中，研究者比较了2 , 581例NSCLC患者配对的组织学或者细胞学标本与ct DNA 标本的EGFR突变吻合度。结果显示，在真实世界中，血液检测较组织学/ 细胞学检测具有较高的特异性，在亚太地区患者中达到97.2%，说明血液检测的假阳性率低，血液检测EGFR基因突变的敏感性为49.6%，血浆与组织的一致率为58% 。就上述研究可以看出，ctDNA 检测EGFR突变的特异性较高，而敏感性较低，因此对于血浆EGFR突变阴性结果的解读必需慎重。 2.2 ct DNA 的临床应用 由于ct DNA 检测基因变异相对快速、便捷，可应用高通量的测序方法，并且部分肿瘤外周血中ct DN A的表达水平高于CTC。因此，对于基因检测方面，虽然两者可互为补充，但可能ct DNA更具一定优势。对于EGFR突变检测，如上所述的研究已经证实了ctDNA 检测EGFR突变的可靠性。因此，美国和中国均已有官方批准的血浆检测EGFR突变的商业试剂盒。对于ALK 融合基因检测，目前尚无明确的标准检测方法。 但是肺癌的异质性较大，突变谱也较广泛，通过ctDNA 诊断肺癌的标准尚未统一，是否循环中检测到某种基因变异或者某几类基因变异的组合即可诊断肺癌，目前尚无定论。这是ct DNA相对于CTC的不足之处。 酪氨酸结构域的二次突变是导致酪氨酸激酶抑制剂耐药的重要原因之一。因此，通过c t DNA 检测获得性耐药基因的表达，成为了目前研究的重点方向之一。2015年发表在Nature Medicine中关于三代EGFR-TKIs耐药机制的研究报道，更是提示ct DNA 检测在这一方面的前景。该研究通过随访15 例T790M突变的患者接受AZD9291 治疗，动态监测ctDNA ，发现并证实了AZD9291获得性耐药的突变位点C797S。并且通过动态观察，发现AZD9291存在三种耐药模式 ，一种是耐药后T790M突变与C797S突变同时存在，一种是耐药后仅出现T790M的再次升高，第三种是耐药后即不伴有T790M 也无C797S的出现。 3. 总结 在将来，随着我们检测方法的不断进步，期待液态活检技术能够真正应用到临床，指导肺癌精准治疗，成为延长患者生存期的必备手段。 |
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