细菌学检验不仅对疾病的病原学诊断有重要价值,同时对临床治疗的药物选择也具有十分重要意义。 一、生物学性状 肺炎链球菌革兰染色呈阳性。球形或矛头状,成双排列,少呈链状。在组织中可形成荚膜(人工培养荚膜逐渐消失),无鞭毛及芽孢。 2. 培养特点 (1) 培养基 肺炎链球菌对营养要求较高,需采用质量好的哥伦比亚琼脂基础和新鲜血液( 5%马血或羊血) 。 琼脂浓度可适当下降至1%~1.2%,有利于肺炎链球菌的生长。 1)标本处理 及时将采集标本接种到适当的培养基上是提高分离率的前提。因为,肺炎链球菌对干燥、对寒冷的抵抗力均较弱,在标本离开机体暴露于外界复杂的环境中,其存活率十分低,不及时接种适当培养基是导致分离率低的主要原因。 2)选择性分离培养基 培养基中添加5μg/ml庆大霉素有利于肺炎链球菌的分离。 3)培养环境 5~10%CO2、35℃培养24~48h。 (3)肺炎链球菌的菌落形态 在营养丰富的培养基上,肺炎链球菌形成扁平、中间有凹陷的典型菌落,少数菌可呈粘液型菌落。 3.抗原结构 (1)种属特异性抗原:为菌体多糖抗原,存在于肺炎链球菌的细胞壁。 (2)型特异性抗原:是存在于肺炎链球菌荚膜中的一种多糖多聚体,可溶于水,据此抗原可将肺炎链球菌分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……等个型,其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型致病性最强。 (3)菌体核蛋白抗原:存在于菌体深部,为蛋白质,无特异性。 二、肺炎链球菌鉴定 肺炎链球菌的鉴定,主要应与甲型溶血性链球菌鉴别。其中以胆汁溶菌试验、菊糖发酵和optochin试验最为常用。必要时可作小鼠毒力试验加以鉴别。在上述试验中,肺炎链球菌均应阳性,而甲型溶血性链球菌为阴性。必要时可用特异性单克隆乳胶或自动化仪器等相应鉴定卡作鉴定。 1. 溶血性检查 肺炎链球菌在厌氧或二氧化碳环境中溶血能力大大加强,草绿色溶血环很大,可与其他草绿色链球菌相区别。 2. Optochin(OP)敏感试验 optochin即乙基氢化叩卟啉,因结构似于奎宁,故又称为乙基氢化羟基奎宁。该药对肺炎链球菌的作用机制是干扰其叶酸的合成。 optochin敏感试验方法似药敏试验。挑取被检菌,密涂于血平板上,贴上含5μg/片的optochin纸片,置5~10%CO2的大气中(或烛缸),35℃孵育过夜。抑菌环直径>=14mm为敏感,推断为肺炎链球菌。抑菌环直径<> 也有例外,我们在实际工作中检出过耐optochin的肺炎链球菌,并发现大多数的缓症链球菌和部分口腔链球菌对optochin的抑菌环直径>=14mm。应注意鉴别。 但大多数肺炎链球菌对苯唑西林(Oxacillin,OX)是敏感的(除外PRP),而缓症链球菌和口腔链球菌对OX耐药。这可作为辅助鉴别点。 3. 胆汁溶菌试验 自溶酶是一种L-丙氨酸--N-乙酰胞壁酰胺酶,能切断肽聚糖上L-丙氨酸与N-乙酰胞壁酸间的连接键,从而破坏细胞壁,使菌溶解。 自溶酶在菌生长的稳定期被激活,也可被胆汁或胆盐等活性物质激活,从而促进培养物中的菌体溶解。肺炎链球菌胆汁溶菌试验为阳性,甲型溶血性链球菌的胆汁溶菌试验为阴性。 (1)试管法: 取新鲜培养物分装于两支试管内(每支1ml),其中一支加入10%的去氧胆酸钠溶液0.1ml或纯牛胆汁0.2ml,另一支加入无菌盐水两滴(对照),15min后,阳性者细菌被溶解,试管内液体呈透明状,阴性者无变化。 (2)平皿法: 加一滴10%的去氧胆酸钠溶液或纯牛胆汁于被检菌菌苔上,15min后,阳性者细菌菌苔被溶解,阴性者无变化。试验应有已知肺炎链球菌作阳性对照。 4.乳胶凝集试验 结果准确、快速、特异性高。 5. 荚膜肿胀试验 取一滴抗血清与一滴菌悬液混匀,加少量美蓝液混合后加盖片,室温10~20min后,用油镜检查,如查到菌体呈兰色,周围绕有界限明显未染色的膨大空白圈为阳性。可用于肺炎链球菌的分型。 6. 凝集试验 包括血清凝集试验、SPA(葡萄球菌蛋白A)协同凝集试验、反向乳胶凝集试验等方法。 三、肺炎链球菌的药敏试验 K-B法:采用Mueller-Hinton琼脂+5%羊血培养基。直接菌落悬液法(0.5麦氏单位菌液,在15分钟内接种完)作为接种液。 稀释法:包括琼脂稀释法、肉汤稀释法和Etest法。 培养条件:为35℃ 、5%CO2培养20~24小时。质控菌株ATCC 49619。 1.肺炎链球菌的耐药机制 青霉素G耐药肺炎链球菌(PRP)的耐药机制是肺炎链球菌有6种青霉素结合蛋白(PBP)发生改变,因为PBP1a/1b和PBP2a/2x/2b是β-内酰胺类抗生素的作用靶位,改变后使PBP与青霉素G的结合力下降; 青霉素G耐药肺炎链球菌(PRP)始发现于1967年; 多重耐药肺炎链球菌(MDR)1977年首次在南非爆发流行。 肺炎链球菌对奎诺酮类抗生素的耐药主要是由该菌产生拓扑酶所致。 肺炎链球菌对大环内酯类抗生素的耐药机制主要为靶位的改变,即核糖体50S亚单位改变所致,由ersB(erythromycin resistance methylase)基因介导,其耐药表型为MLS,即对大环内酯类、林可酰胺类和链阳霉素B交叉耐药。另一耐药机制为主动外排系统,由mefA基因介导,其耐药表型为M,即对14元环(红霉素、罗红霉素、克拉霉素、地红霉素、氟红霉素)、15元环(阿奇霉素)大环内酯类低水平耐药,而对16元环大环内酯类(罗他霉素、柱晶白霉素、交沙霉素、麦迪霉素、麦白霉素、螺旋霉素、乙酰螺旋霉素、米欧卡霉素)、林可霉素和链阳霉素B敏感。 耐青霉素肺炎链球菌的传播主要有两种途径: (1)克隆传播,是耐药菌株从一个国家或地区传播到另一个国家或地区。 (2)基因水平转移,是把耐药基因转移到敏感菌株中。 过度使用抗生素是耐药菌株传播的危险因素。一般认为在抗生素的压力选择下,敏感菌株被杀死,耐药菌株确能生存下来, 或者其他相关链球菌耐药的DNA序列通过基因转移在肺炎链球菌之间传播。 研究发现证实儿童鼻咽部存在“隐匿性耐药克隆株” 。 随着我国儿童β-内酰胺类抗生素大量使用, 可以预计不久的将来, 不敏感的肺炎链球菌将会急剧增加。 2.耐青霉素肺炎链球菌的检测 纸片扩散法对β内酰胺类药物结果的准确性不够,用1μg/片苯唑西林(OX)筛选肺炎链球菌对青霉素耐药时,当抑菌环直径小于20mm时,就必须做稀释法证实是耐药。 3.肺炎链球菌的药敏报告 用1ug/片苯唑西林纸片测试青霉素敏感性,当抑菌环≥20mm或MIC≤0.06ug/ml可报告青霉素敏感。并同时可报告氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、头孢克罗、头孢地尼、头孢吡肟、头孢他美、头孢克肟、头孢噻肟、头孢丙烯、头孢曲松、头孢呋辛、头孢泊肟、头孢唑肟、亚胺培南、氯碳头孢和美罗培南敏感而不需要再测定这些药的敏感性。 当苯唑西林抑菌圈≤19mm时应确定青霉素、头孢噻肟或头孢曲松的MICs,因为抑菌环≤19mm可以发生在青霉素耐药、中介或敏感菌株中。 当从血液或脑脊液中分离出肺炎链球菌,应常规报告MICs。测定的药物应包括青霉素、头孢噻肟或头孢曲松、美罗培南和万古霉素。 总结 1. 肺炎链球菌寄居于人的上呼吸道中,是条件致病菌; 2.肺炎链球菌对营养要求较高,在含有新鲜血液的培养基中生长良好; 3.以optochin 试验和胆汁溶菌试验将肺炎链球菌与其他α-溶血链球菌相区别; 4. 血清学鉴定特异性高; 5. 要注意对PRP和MDR的检测。 转载自检验医学网
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