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氮是植物生长发育的重要营养元素。提高氮素利用效率，从而减少氮肥的使用并降低其对环境的污染，是农业领域的重点研究方向。大多数有氧植物，包括主要作物，以硝酸盐为主要氮源，硝酸盐对农业生产非常重要，而响应硝酸盐反应的潜在调控基因尚未充分鉴定。 2017年8月，山东农业大学在《New phytologist》上发表题为“The Arabidopsis CPSF30-L gene plays an essential role in nitrate signaling and regulates the nitrate transceptor gene NRT1.1”的论文，鉴定新的硝酸盐调控基因，揭示硝酸盐信号网络。 发表杂志：《New phytologist》 影响因子：7.33 基迪奥有幸参与该项目，配合完成了野生型和突变体的转录组测序及生物信息学分析，筛选到一批特异性差异表达基因，并对其进行功能注释和调控分析，为揭示硝酸盐信号网络奠定了基础。 下面我们为大家解读一下这篇文章。 本研究鉴定了一种硝酸盐调控突变体cpsf30，通过图位克隆得到突变基因为CPSF30-L，突变表型可以通过表达CPSF30-L野生型65kDa蛋白而恢复。在响应硝酸盐过程中，CPSF30-L位于NRT1.1的上游，并独立于NLP7起作用。cpsf30突变体中，NRT1.1基因的多腺苷酸化位点发生了改变，这可能是CPSF30-L调控NRT1.1的机理。转录组分析显示，氮相关cluster在cpsf30突变体的差异表达基因中富集。这些研究结果表明，CPSF30-L通过调节NRT1.1表达介导硝酸盐信号转导，为硝酸盐信号网络增加了一个重要组成部分。
研究目的：鉴定参与拟南芥中硝酸盐调控的新基因，研究硝酸盐信号网络。 研究思路： 利用YFP-NRP体系结合甲基磺酸乙酯诱变（EMS）筛选硝酸盐调控突变体，鉴定到突变体Mut65在根中比野生型（WT）具有更低的荧光（图1），可能携带一个或多个涉及硝酸盐信号传导的诱变基因。 图1 野生型拟南芥和突变体Mut65在荧光显微镜下的表现。上图为白光，下图为荧光。 基于这种弱荧光表型，将突变基因定位于拟南芥1号染色体的At1g30460（CPSF30），它的第一外显子具有G-to-A突变，导致第126位的Gly转化为Arg（图2）。 图2 Mut65基因的图位克隆及突变位点 CPSF30基因编码切割和聚腺苷酸化特异性因子，存在两种蛋白，分别为28kDa和65kDa，命名为CPSF30-S和CPSF30-L（图3a）。为了确定哪一种蛋白在硝酸盐信号传导中起作用，将两种cDNA转化到Mut65突变体中，发现CPSF30-L可以缓解弱荧光表型，而CPSF30-S不能（图3b,c）。另外，RNAi实验也说明编码65kDa蛋白质的CPSF30-L负责cpsf30-2中的弱荧光表型，从而导致硝酸盐调节缺陷。因此，将Mut65更名为cpsf30-2。 图3 两种CPSF30蛋白结构及其对Mut65突变体表型的回复。 CPSF30-L含有另外的YTH结构域以及三个锌指基序。 为了确定CPSF30-L蛋白是否参与硝酸盐反应，检测了三种已知的硝酸盐反应基因的表达情况（图4a）。研究发现，这三个基因在cpsf30-2中和RNAi干涉条件下相对表达量相对于WT显著降低，在CPSF30-L / cpsf30-2系中恢复到接近WT水平，但CPSF30-S / cpsf30-2中不表达（图4），表明这三种硝酸盐反应基因的表达量降低是由CPSF30突变引起的，CPSF30-L是硝酸盐信号传导中的重要调控基因。 硝酸盐调控以两种不同的方式工作：仅在铵存在时（氮饥饿）调节硝酸盐反应，此类以NRT1.1基因为代表；无论铵存在与否都能调控硝酸盐信号，以NLP7和NRG2基因为代表。通过检测氮饥饿后cpsf30-2中硝酸盐反应基因的表达和YFP荧光情况，发现其与nrt1.1突变体不同，无论铵存在与否，都能调控硝酸盐信号（图4）。 图4 氮诱导条件下硝酸盐反应基因的表达情况 CPSF30-L在整个植株中都表达，在叶片中表达最强（图5a）。由CPSF30-L启动子驱动的GUS基因在其转基因植株中的组织化学分析显示，CPSF30-L主要在叶的维管组织、根、茎和花中表达（图5b）。35S启动子控制下的CPSF30-L的全长cDNA与绿色荧光蛋白（GFP）融合后得到的转基因植株显示，蛋白质定位于细胞核中（图5c），烟草细胞瞬时表达实验也证明该蛋白质定位于细胞核中（图5d）。 图5 CPSF30-L的表达模式与亚细胞定位 cpsf30-2突变体中，根和芽的硝酸盐积累显著低于WT（图6a），而在CPSF30-L / cpsf30-2中该表型得以恢复（图6a,b）。NRT1.1从外部吸收硝酸盐到根中，NRT1.5将硝酸盐通过木质部运输到芽，NRT1.8将硝酸盐转运到不同的组织。cpsf30-2根系中NRT1.1和NRT1.5的表达比WT显著降低（图6c），在嫩芽中NRT1.1和NRT1.8的表达比WT显著降低（图6d）。CPSF30-L通过调节根中NRT1.1和NRT1.5的表达，以及芽中NRT1.1和NRT1.8的表达，调节硝酸盐的吸收和转运。 已知NIA1，NIA2，NiR，GLN1.1和GLN1.3等基因与硝酸盐同化有关，cpsf30-2的芽中NiR和GLN1.1表达量较WT高，根中NIA，NiR和GLN1.3基因表达较WT高（图6f），这种增强的基因表达在CPSF30-L / cpsf30-2中被逆转（图6e,f）。cpsf30-2的根中氨基酸含量显著增加，而芽中为发现明显变化，可能与幼苗太小有关。这些结果表明，CPSF30-L是硝酸盐吸收、累计和同化的重要调控因子。 图6 CPSF30-L调节氮的转运和同化 NRT1.1在硝酸盐信号传导中起重要作用，cpsf30-2突变体中NRT1.1的表达显著降低（图7a），而在NRT1.1的突变体chl1-5和chl-13中CPSF30-L的表达没有显著变化（图7b）。双突变体cpsf30-2 chl1-13中，根的YFP荧光水平与chl1-13相似，但低于cpsf30-2（图8a,b），说明CPSF30-L在硝酸盐信号中可能位于NRT1.1上游。 此外，在双突变体中硝酸盐响应基因的相对表达水平与单突变体chl1-13相似，远低于WT中的相对表达水平。将NRT1.1转基因到cpsf30-2中，弱YFP荧光、硝酸盐含量降低和硝酸盐响应基因的抑制诱导等表型都恢复到与WT相似的水平（图9a-d）。 研究结果表明，CPSF30-L和NRT1.1在硝酸信号通路的同一途径中，CPSF30-L位于NRT1.1的上游。 图7 CPSF30-L和NRT1.1在突变体中的表达 图8 CPSF30-L和NRT1.1在氮信号通路的相同途径中
图9 NRT1.1能回复cpsf30-2的突变表型 鉴于CPSF30-L在可变多聚腺苷酸化中起重要作用, 检测发现NRT1.1的3’ UTR在突变体和WT之间具有不同的多聚腺苷酸化，说明CPSF30-L通过NRT1.1的可变多聚腺苷酸化调控硝酸盐信号。 NLP7是另一个主要的硝酸盐调节剂，cpsf30-2中NLP7的表达和nlp7-4中CPSF30-L的表达与WT相比都没有变化，而双突变体中三种硝酸盐反应基因的相对表达显著低于两种单突变体（图10c），两个基因的单突变体和双突变体的遗传分析显示，双突变体的YFP荧光弱于单个突变体的YFP荧光（图10a,b），表明CPSF30-L和NLP7可能在硝酸盐信号通路中起不同的作用。
图10 NLP7在氮信号通路中与CPSF30-L相互独立 氮处理2小时后，WT和cpsf30-2中分别有633和724个基因的表达显著改变，298个在WT中特异性差异表达，389个基因在cpsf30-2突变体中特异性差异表达。二者存在335个共同的DEG，其中202个在WT和突变体之间变化超过20％。 对富集687个特异性DEG和202个共同DEG进行了富集，发现六种GO terms与氮有关，包括response to nitrogen compound、nitrate metabolic process、nitrate assimilation、response to nitrate、reactive nitrogen species metabolic process和nitrate transport。之前发表的CPSF30突变体oxt6的转录组中差异基因GO分析也显示了类似的结果。 这些差异基因涉及硝酸盐转运和同化的很多基因，如NRT1.7，NRT1.8，NRT2.1，NIA1和NiR，表明CPSF30可以调节许多氮相关基因，与NRT1.1位于相同的硝酸盐调节途径中，是重要的硝酸盐调控因子。 此研究利用YFP-NRP体系结合甲基磺酸乙酯诱变（EMS）筛选鉴定到一种硝酸盐调控突变体，通过图位克隆得到突变基因为CPSF30-L。发现硝酸盐反应基因的表达量降低是由CPSF30突变引起的，CPSF30-L是硝酸盐信号传导中的重要调控基因。CPSF30-L主要在叶的维管组织、根、茎和花中表达，其蛋白质定位于细胞核中。 检测发现CPSF30-L调控硝酸盐的吸收、积累和同化。在响应硝酸盐过程中，CPSF30-L位于NRT1.1的上游，并独立于NLP7起作用。转录组分析显示，氮相关cluster在cpsf30突变体的差异表达基因中富集。 这些研究结果表明，CPSF30-L通过调节NRT1.1表达介导硝酸盐信号转导，为硝酸盐信号网络增加了一个重要组成部分。
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