单细胞研究的前哨：单细胞分离

单细胞RNA测序技术在近年来发展迅速，带来了许多让人眼前一亮的新成果。人类细胞图谱（Human Cell Atlas）计划也在去年启动，被MIT Technology Review评为十大突破技术之一。

人体中究竟有多少种类型的细胞？现阶段我们恐怕无法给出一个确切的答案。多细胞生物的每个细胞都携带着相同的遗传学信息，不过，它们又是独一无二的。不同类型的细胞采用特定的基因组合来产生蛋白质。

那么，检测细胞内的RNA分子也许能提供一些线索。基于这个原因，单细胞RNA测序技术在近年来发展迅速，带来了许多让人眼前一亮的新成果。人类细胞图谱（Human Cell Atlas）计划也在去年启动，被MIT Technology Review评为十大突破技术之一。

在此，我们将回顾单细胞RNA测序技术的发展。不过，我们首先要聊聊单细胞分离，这似乎是单细胞研究中最困难的一步。

单细胞的分离

从异质性的细胞群体中分离单细胞，目前主要有三种选择：手动分离、荧光激活细胞分选和微流体技术。当然，除了成熟的方法，巧妙的新方法也在不断涌现，能以更高的准确性和特异性来分离单细胞。

如果你想要的细胞已经处于悬浮状态（比如循环肿瘤细胞），而且含量相对比较丰富，那么流式分选将是你的理想选择。如果样本是实体组织，我们可以用酶分解掉胶原和其他细胞外蛋白。不过，酶学消化对细胞影响较大，甚至可能改变基因转录情况。把组织细胞制备成悬液之后，我们就可以通过特异性的荧光标签分离出自己想要的细胞。进一步拿到单细胞是比较棘手的一步，也许要借助微流体设备。

将细胞分散到悬液中，会失去它们在组织里的位置信息。如果你想了解单细胞所处的环境和它们以前的邻居，就需要用到激光捕获显微切割技术。这种技术通过扫描组织切片来定位感兴趣的细胞，并将其提取出来。操作者需要非常小心，以免切到细胞或细胞核。数量极为稀少的细胞只能用毛细管等器具手动获取。

此外，一种称为体内转录组分析（TIVA）的方法也被开发出，可以利用TIVA标记在光激活情况下捕获来自活体组织单个细胞中的mRNA，助力转录组研究的开展。

各种技术的优缺点

荧光激活细胞分选（FACS）

样本类型：解离的细胞悬液
 
优点：
1. 细胞表面标志物的特异标记
2. 多个同时存在的标记可确保特定细胞的分离
3. 可将细胞分选至96孔或384孔板，纯度接近100%
缺点：
1. 需要特异针对细胞表面标志物的抗体
2. 无法扩展到大规模项目
3. 通量低，需要大的起始量
4. 回收的细胞受到机械应力
5. 在分选前需要优化

微流体

样本类型：解离的细胞悬液 

优点：
1. 能够从少量样本中分离无法培养的细胞
2. 可根据细胞表面标志物分离特定细胞
3. 稀有的循环肿瘤细胞已被成功分离
缺点：
1. 成本高

显微操作

样本类型：解离的细胞悬液

优点：
1. 从不同的发育阶段分离单个细胞，如神经元
2. 从多样化的群体中分离细胞 
缺点：
1. 通量低，需要大的起始量
2. 细胞特异性由显微镜决定，并利用微量移液管分离，可能不够准确

光学镊子

样本类型：解离的细胞悬液

优点：
1. 与微量移液管相比，细胞分离更加集中可控
2. 自动分选单个细胞
3. 通量高
4. 感兴趣细胞的荧光标记 
缺点：
1. 因安装门槛高，只有少数实验室可采用

激光捕获显微切割（LCM）

样本类型：组织样本

优点：
1. 在天然环境下从完整组织中分离细胞，保留所分离细胞的RNA完整性
2. 从感兴趣的组织中快速分离单细胞
3. 可与显微镜技术结合，了解组织中单细胞时间转录组学
4. 无需解离组织，制备细胞悬液 
缺点：
1. 组织必须是冷冻保存或固定的
2. 显微切割可能存在挑战
3. 小的细胞可能难以分离
4. 需要适当的组织处理，以维持完整性
5. 在细胞分离和组织切割时，可能存在RNA污染

体内转录组分析（TIVA）

样本类型：组织样本

优点：
1. 研究活细胞中单个细胞的时间转录组学
2. 直接捕获单个细胞中的mRNA，保留细胞对微环境的反应
3. 非侵入性操作 
缺点：
1. 通量低
2. 每次研究一种组织