Thompson LR, Sanders JG, McDonald D, Amir A, Ladau J,Locey KJ et al (2017). A communal catalogue reveals Earth’s multiscalemicrobial diversity. Nature. 本文今年11月1日在线发表,23日正式出版,翻译导读转载自'http://mp.weixin.qq.com/s/dAyP0dHxcAdcXaaKoak7Hghttp://mp.weixin.qq.com/s/dAyP0dHxcAdcXaaKoak7Hg'公众号,己获授权。 原文链接:https://www./articles/nature24621 全文PDF: https://www./articles/nature24621.pdf 翻译原文:http://mp.weixin.qq.com/s/dAyP0dHxcAdcXaaKoak7Hg 文章简介: 我们对微生物世界的重要性和多样性的认识日益增强,然而对它们的基本结构却认知有限。近年来,基因测序领域取得了一系列新进展。但由于缺乏标准化的分析方法,常用分析框架又存在诸多缺陷,使微生物组的研究受到了一定限制,进而制约了人们对环境微生物基本结构的认知与发展。本文作者对地球微生物组计划(EMP)中数百名研究人员收集的微生物群落样本进行了元分析。相应的说明及新的基于精确序列而非OTU聚类的分析方法,将增强多项研究中对于细菌和古菌的核糖体基因序列的分析,并将多样性的探索推向前所未有的规模。其结果为进一步深化微生物组研究作出了有益尝试:一是建立了环境微生物基因序列参考数据库,为深入研究未知环境的微生物组构成提供了数据基础和参考依据; 二是建立了微生物基因数据框架,为优化完善地球微生物多样性的描述模式做出了积极探索。
方法介绍: 1.样品收集 EMP向全球科学界征集环境样本和相关数据,跨越不同的环境,不同空间、时间和物理化学共变。来自97个独立研究的27751个样本代表了不同的环境类型(图a)、地理位置(图b)和化学反应。所有样品进行了DNA提取和测序,并对在整个数据库的细菌和古菌部分进行了分析。 图1. 环境类型和样品来源。 2.DNA提取,PCR扩增,测序和序列预处理 1).DNA 提取使用 MO BIO PowerSoil DNA extraction kit试剂盒。 2).PCR扩增使用16SrRNA V4区域上的配对引物的515F-806R。 3).测序使用Illumina HiSeq或MiSeq测序平台。 4).测序所得数据使用QIIME 1.9.1 script split_libraries_fastq.py拆分序列并以默认参数进行质量控制随后生成FASTA序列文件。 3.序列标记、OTU筛选以及群落分析方法 考虑到与植物相关的样本以及无宿主影响的样本中,三分之一及以上的序列不能与现有的rRNA数据库匹配,该研究中使用了一种无需参考序列的方法,Deblur,来去除错误的序列并提供了单核酸精度上的sOTU(sub-OTU),该文章中称为“标记序列”(tag sequence)。由于早期EMP计划中的测序长度为90bp,为了将不同时期的序列结果统一起来,进行比较,该研究将所有的序列都切除到了90bp,相应的结果也辅助说明了90bp,100bp和150bp等不同长度不影响研究结果。在与参考数据库(Greengenes 13.8 和Silva 128)的全长序列进行比对时,使用VSEARCH工具来全局比对,并要求100%相似性。 对于90bp的Deblur结果,每个样本均随机抽取了5000个观测到的序列进行分析微生物群落的alpha多样性(observed_otus, shannon, chao1, faith_pd)和beta多样性(基于UniFrac距离矩阵,进行PCoA分析)。 16S rRNA基因拷贝数的计算:基于PICRUSt 1.1.0的命令行脚本“normalize_by_copy_number.py”,将每一个OTU的丰度除以相应推测出的16S rRNA基因的拷贝数。 随机森林的方法对样本进行分类分析:针对Deblur 90 bp 结果中2000个样本,使用随机森林分类树的方法,将不同环境下的样本划分至相应的环境标签中。在方法中使用了R语言下的caret和randomForest包。 SourceTracker分析来确定tag sequence在多个环境样本中的分布程度。该分析利用Source Tracker 2.0.1来完成。在分析之前,每一个样本的序列总数均稀释至1000。 Deblur算法简介: 1). 将样本中序列进行统计个数并由大到少依次排列,依次记录reads ri,counts ci,i = 1,2,…Nreads,ci依次递减。以i =1为例,假设 c′1 为 r1 在初始样本中的真实个数,由于测序过程中的一些错误,c′1 <>,α是测序过程中出现错误的平均概率,为了得到的 r1 的真实个数,进行以下计算:c′1 =c1/(1-α) 2). 在增加c1之后,需要降低相应的其余序列的个数,因为在该算法中,假设r1测到的真实个数降低,是由于被误测成了其余序列。因此这里选用在不同Hamming距离(即mismatch,dik)下的错误率 β(dik) 来估计其余序列被测成r1的个数,以此来校正不同序列在测序过程中的真实个数。以 ck 为例,1 k< nreads,被误测成r1的序列的个数应该是:ck="">β(dik)]c′1 3). 重复上述过程,i = 1, 2,…Nreads,i <><> 备注:不同mismatch下的错误率是基于多个Miseq和Hiseq测序结果的收集起来的统计值。 4. 多样性分析 通过Greengenes数据库建树、UniFrac距离计算,用QIIME进行alpha-多样性(图a)分析,richness与纬度、pH和温度的相关性,beta-多样性(图c)的分析,以及16S rRNA基因平均拷贝数的计算(图d)。 图2. Alpha和Beta多样性,以及预测的16S rDNA拷贝数。 5.用更为精确的分类单元代替OTU聚类。 微生物生态不再需要OTU聚类,而是一个更为精确的分类单元。这样一来,序列的特异性更高,环境分类也可以更细,使我们能够在更精确的分辨率下观察和分析微生物分布模式。在该文章中,作者以shannon熵值为标准,分别对tag sequence和较高的物种分类在不同环境中的分布进行分析。可以看出,新方法中的标记序列对环境具有较高的特异性,分布偏向于一个或几个环境(低Shannon熵);相比之下,更高的物种分类学水平往往更均匀地分布在不同的环境(高Shannon熵,低特异性)(图a)。不同物种分类级别上的所有标记序列的熵的分布也证实了这一观点(图b) 。为了精确衡量每个分类单元对环境的差异,作者也探究了熵随着生态系统距离的变化而变化的模式(图c)。 图3. 巢式群体组成(展示大样本中物种分布规律的好方法)。 图4. 环境中精确序列和属水平分类结果比较。 |
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