外泌体丨RNA研究经典案例

AIR2000 2017-11-30

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上期我们简单介绍了外泌体概念、分离方法及其临床应用，为大家掀开了外泌体神秘的面纱，相信大家已经对外泌体有了初步的了解。本期小编总结了几篇外泌体在临床RNA研究方面的应用案例，大家快来一睹科研界的“蚁人”--外泌体的风采吧！

案例一：健康及癌症病人血浆中胞外囊泡的RNA表达谱研究

胞外囊泡会选择性包装RNA，可以作为潜在疾病生物标志物。为了系统地描述循环系统RNA（exRNA）表达情况。我们对来源于50名健康个体和142癌症患者血浆的胞外囊泡进行了RNA测序分析，每个样本测序深度约1260万原始测序读长，通过mapping处理发现约540万个 RNA读长，包括微RNA（约40.4％），piwiRNAs（约40.0％），假基因（约3.7％），lncRNAs（约 2.4％），tRNA（约2.1％），和mRNA（约2.1％）。通过表达稳定性测试，我们发现了一组miRNA在不同的样本中具有相对一致的表达风度，这可以作为exRNA定量分析是的内参基因。通过进行协方差的多因素分析，我们发现这些exRNAs与年龄，性别和不同类型的癌症显著的相关。下调的miR-125a-5P和miR-1343-3p显示出与所有测试的癌症类型的关联（错误发现率FDR<>）这是目前数据量最大的胞外囊泡RNA测序研究，我们的研究不仅为exRNA提供了一些基准参考信息，同时也揭示了一组具有成为生物标识物潜力的RNA。

图1.转录组分析外泌体中RNA的种类

原文:Tiezheng Yuan. Plasma extracellular RNA pro-files in healthy and cancer patients. Scientific Reports, 2016.

案例二: 脂肪来源的干细胞通过微囊泡传递miR-31促进血管生成

细胞分泌物刺激是基于干细胞的治疗性诱导血管生成的重要机制，近些年细胞释放的微囊泡被发现在细胞向血管内皮细胞或平滑肌细胞分化过程中具有介导细胞间通讯的重要作用。本研究的目的在于探索干细胞来源的微囊泡对治疗性血管生成的影响。我们第一次观察到的脂肪来源干细胞（ASCs）分泌的微囊泡能够增加人脐带血内皮细胞的迁移和管腔形成。体外实验表明，内皮分化培养基预处理的脂肪来源干细胞微囊泡的分泌能力会提高，囊泡诱导血管生成的能力也会加强。RNA分析表明，ASCs释放的微囊泡中含有miRNA和内皮分化培养基预处理的ASCs分泌的微囊泡中miR-31的含量会上升。进一步的研究显示微囊泡中的miR-31能够促成内皮细胞的迁移和管形成，小鼠主动脉环微血管生长和血管形成。此外，HIF-1，一个抗血管生成的基因，被认定是m iR-31在血管内皮细胞靶mRNA。我们的研究结果表明，ASCs来源的微囊泡，尤其是内皮分化培养基预处理后ASCs分泌的微囊泡可以通过miR-31促进血管生成。

图2.ASCs释放的微囊泡中的RNA

原文：Ting K.Adipose-derived stem cells induce an-giogenesis via microvesicle transport of miRNA-31 .Stem Cells Translational Medicine,2016.

案例三：卵巢癌细胞通过基质细胞来源的外泌体传递的miR21靶向APAF1获得紫杉醇抗性

晚期卵巢癌细胞通常会发生大网膜脂肪组织处的转移，但是网膜基质细胞来源的分子对卵巢癌生长的影响还未见太多报道。本文中，我们通过二代测序技术发现肿瘤相关的脂肪细胞和成纤维细胞中miR21的表达量明显高于卵巢癌细胞。通过功能研究发现，肿瘤相关的脂肪细胞和成纤维细胞的miR21可以转移到卵巢癌细胞中，从而抑制卵巢癌细胞的凋亡并通过结合一个新发现的靶mRNA—APAF1 赋予其化疗抗性。这些数据表明，转移性卵巢癌细胞的恶性表型可通过从相邻的网膜基质细胞来源的外泌体递送miR21来获得，抑制基质细胞来源的miR21可能是治疗转移性或复发性卵巢癌的一个新策略。

图3-1.肿瘤相关的脂肪细胞分泌的外泌体中miR21表达上调

图3-2. 卵巢肿瘤组织和肿瘤细胞系中miR21的表达差异情况

原文：Chi Lam Au Yeung. Exosomal transfer of stro ma-derived miR21 confers paclitaxel resistance in o varian cancer cells through targeting APAF1. Nature Communications,2016.

案例四:长链非编码RNA HOTAIR的表达与膀胱癌的进展相关并且存在于膀胱癌患者尿液外泌体中

外泌体是30-150nm具有膜结构的分泌性囊泡结构，外泌体很容易从包括尿液在内的体液中分离出来。外泌体中包含母细胞的蛋白质、miRNA、mRNA和长链非编码RNA（lncRNA）。虽然已有报道从血浆中分离出的miRNA、lncRNA和蛋白质可作为良性或恶心疾病的潜在生物标志物，但是在膀胱癌患者尿液是否存在相关的生物标志物还不清楚。lncRNA是一类长度大于200bp且不具备编码蛋白能力的RNA，在肿瘤生物学中发挥着关键作用，与肿瘤相关的lncRNAs的数量不断增加，同时需要开发lncRNAs标志物和治疗方法。之前报道中lncRNA HOTAIR已经显示出促进肿瘤发生发展和影响肿瘤不良预后的作用，HOTAIR在癌症生物学中的重要性已经引起大家使用HOTAIR作为生物标志物和潜在的治疗靶点的广泛兴趣。在本文中，我们发现在UBC患者尿液外泌体中HOTAIR和几个肿瘤相关lncRNAs丰度有所提高。在UBC细胞系中特异性敲低HOTAIR可以抑制细胞在体外的迁移和侵袭能力，改变上皮到间质转化（EMT）的基因，包括SNAI1，TWIST1，ZEB1，ZO1，MMP1 L AMB3和LAMC2表达。这些数据，表明尿液来源外泌体中的lncRNA具有作为生物标志物和治疗靶点的潜力。

图4.外泌体T24和TCC-SUP中肿瘤相关lncRNA和mRNA富集

原文：Berrondo C. Expression of the long non-cod ing RNA HOTAIR correlates with disease progression in bladder cancer and is contained in bladder cancer patient urinary exosomes. Plos One,2016.

案例五: 前列腺外泌体中lncRNA富含miRNA种子序列

长链非编码RNA（lncRNAs）是人转录组中最大的一类。这些lncRNA不仅存在于细胞中，同时也存在于细胞来源的细胞外囊泡，如外泌体中。这些lncRNAs在癌症生物学中的功能尚不完全清楚，但他们可以调节基因表达。来自悉尼科技大学的研究人员在最新一项研究中分析了在几组前列腺癌的外泌体和其亲代细胞系的lnc RNAs表达情况。研究发现，不同肿瘤细胞系来源外泌体均富含某些lnc RNAs。这些外泌体lncRNAs本身富含mi RNA种子序列，包括let-7家族成员以及的miR-1 7，miR-18A，miR-20a，miR-93和miR-106b。并且在外泌体中同时伴随相同的miRNAs的高表达。此外，外泌体lncRNAs也含有RNA结合蛋白的结合序列。最常见的两种基序是ELAVL1和RBMX。鉴于外泌体lncRNAs富含miRNA种子序列与RBP部位，其相互作用可能会在前列腺癌癌变过程中发挥重要功能。

图5. A) 前列腺癌细胞（PC3、DU145、LNCaP和VCaP）外泌体中lncRNA ; B) 前列腺细胞外泌体中lncRNA表达

原文：Ahadi A.Long non-coding RNAs harboring mi RNA seed regions are enriched in prostate cancer exosomes.Scientific Reports, 2016.

案例六: 外泌体传递內源性竞争长链非编码RNA-lncARSR提升肾癌细胞的舒尼替尼抗药性

舒尼替尼耐药是晚期肾细胞癌（RCC）治疗的一个难点。了解这一耐药现象的机制并制定抑制舒尼替尼耐药的有效策略是目前临床应用中面对的重要问题。本文中，我们确定了一个与舒尼替尼抵抗相关的lncRNA（我们命名为lncARSR：lncRNA Activated in RCC with Sun-itinib Resistance）。在RCC细胞中，lncARSR通过竞争性结合miR-34/miR-449来促进AXL和c-Met表达而赋予细胞舒尼替尼抗性。此外，具有生物活性的lncARSR可以被纳入外泌体并被传输到舒尼替尼敏感性RCC细胞，从而传播舒尼替尼抗性。对舒尼替尼抗药性RCC施加舒尼替尼的同时靶向关闭lncARAR或同时施加AXL/c-MET抑制剂可以有效缓解肿瘤细胞对舒尼替尼抵抗。因此，lnc ARSR可以用作预测和治疗舒尼替尼耐药的潜在治疗靶标。