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终于等到了您！不成功不收费可不是随便的承诺，如果您的lncRNA在准备敲降建系时，满足以下两个条件： 1.经典的细胞系：如293T、肺癌A549、胰腺癌Panc-1、血管内皮细胞HUVEC等细胞系。（更多细胞系请发邮件至：geneediting@shbiochip.com咨询您的细胞是否属于伯豪经典细胞系范畴） 2. lncRNA属于Intergenic或Bidirectional这两种lncRNA类型。 那请放心把lncRNA提供给我们。唯一要担心的是这个lncRNA敲降之后，会不会导致细胞大规模凋亡，如果我们在实验过程中发现了这个现象，说明这条lncRNA可能具有强大的细胞增殖/凋亡的调控功能。我们会及时与您反馈并探讨后续的备选实验设计，如瞬时敲降，并通过芯片或测序研究是哪些蛋白家族或者KEGG信号通路基因发生了改变，或建议做过表达细胞建系，来研究细胞表型的具体变化，如果您有更加复杂的课题设计或想法，欢迎发邮件至：geneediting@shbiochip.com，与我们北京大学博士科研团队共同探讨设计。以伯豪生物十多年专注科研服务，累计协助国内课题组发表一千多篇高档次SCI的经验，一定可以为您提供切实可行的技术方案。
SO，问题来了，神马是Intergenic或Bidirectional类型的lncRNA?为啥能不成功不收费？这里面有神马原理没？
各位老师好，我是科研小秘书 友问有答，为了解释上面的疑惑，我们先回顾下lncRNA的研究思路 随着生物技术检测手段的发展，我们发现人类基因组中90%的转录产物并不能翻译蛋白。其中包含一类序列长度大于200 nt的非编码RNA——lncRNA。这些年来的研究表明，lncRNA以多种调控方式决定了生物体发育，疾病发生等过程。从目前发现的lncRNA数目来说已有5万余条。但是，到目前为止，真正已知功能的lncRNA不到1000条（即只有2%的LncRNA进行过功能研究）。所以，lncRNA研究领域还是一个充满了潜力的大宝库。每一个研究领域、研究方向都有发现新的lncRNA功能的可能性。 有志于lncRNA研究的您，请与伯豪技术团队一起去进行lncRNA淘金之旅吧！
小友提示：lncRNA文章的影响因子越高，所需要的功能学实验可能需要的就越多。不过，有没有可能少做些功能学实验，同样发高档次的文章呢？这是个问题，回答了会泄漏天机，不回答会得罪老师。给个提示哈：利用各种lncRNA的网站、TCGA、GEO等等进行生信分析，挖掘感兴趣的数据并应用于自己的研究领域中。 经典的实验设计中，大多是通过高通量芯片或测序筛选差异表达的lncRNA，并通过各种生物信息学分析（GO、Pathway、Cis-target、Trans-target、Co-expression、IPA、GSEA、WGCNA等）确认首选的lncRNA，采用qRT-PCR验证表达，Northern blot 去验证高通量筛选的结果，并通过http://www./ 或http://cpc.cbi.pku.edu.cn/ 或CPAT:http://lilab.research./cpat/index.php等预测编码能力，再通过3’RACE，5’RACE 实验去确认其全长。
小友提示：回想三年前，那会用芯片一筛基本就是一篇文章，这样的时代已经一去不复返了。不过，经过这么多年的积累，很多老师手上已经有比较多的高通量数据了，其实lncRNA与基因的各种表达调控关系就蕴藏在高通量数据里面，可以通过各种高级的分析挖掘最有意义的lncRNA，恰巧，伯豪的技术攻城狮都会。 找到 lncRNA 后，接下来的重要工作就是研究其调控方式。 从目前已有研究来说， lncRNA的调控方式是多种多样的，染色质调控，转录调控，转录后调控等。那么，当我们知道某一条 lncRNA 在细胞中特异性表达时，该怎么入手呢？“脑袋跟着屁股走”， 在什么位置，担当着什么样的角色。我们可以通过传统的荧光原位杂交方法（FISH）去确认其细胞定位，来知道它主要在核内还是在核外。如果是核内，那么，接下来考虑的作用方式可以就是染色质调控， 转录调控（结合到启动子区，和某些转录因子互作，Pol II 的抑制子……）；如果是核外， 那么，考虑的作用方式可能是转录后调控（影响 mRNA的稳定性，影响 mRNA 翻译，作为 miRNA 的”sponge”……）。 
小友提示：FISH是一个操作还算比较简单的实验，核心就是一句话：只要爬片做的好，不愁结果拍不到。
在经历上述常规实验之后，下一步非常关键的就是建立lncRNA的过表达或干扰细胞系来研究此lncRNA的功能，这对lncRNA最终能发多少分的文章有至关重要的影响。
lncRNA过表达细胞系： lncRNA的过表达建系相对比较容易，在通过3’RACE，5’RACE获得全长之后，体外合成并构建慢病毒、腺病毒或逆转录病毒载体，导入细胞后加药或荧光筛选即可获得稳转细胞系。  Zusen Fan et al., 2016 Nature structural ＆ molecular biology doi:10.1038/nsmb.3235
lncRNA敲降细胞建系： lncRNA的FISH结果一般有三种情况：细胞质、细胞核、细胞核 细胞质，对于第一种lncRNA，可以通过RNA干扰（RNAi）即可实现敲降，但对于其他两种，由于siRNA进入到细胞核中发挥作用的概率比较低，比较大的影响了lncRNA在敲降方面的功能研究。因此，科学家开始寻求siRNA以外的技术应用与lncRNA敲降方面。随着以CRISPR/Cas9为代表的最具前景技术的基因编辑技术应用崛起，终于让我们在核内lncRNA的敲降方面看到了希望。
小友提示：其实并不是所有定位于细胞核中的lncRNA都不能用RNAi做抑制，著名的HOTAIR就是个例子，只不过敲降效率有点低，操作成本比较高。 伯豪生物于2013年开始投入精力研发CRISPR/Cas9的相关服务，并协助国内各大科研院所累计完成 肺癌、血管内皮细胞、胰腺癌细胞、等几十种细胞的基因敲除、miRNA删除等技术服务。随着近几年lncRNA的研究热度上升，伯豪生物探索尝试了多种CRISPR/Cas9技术进行lncRNA研究的技术方案，诸多项目的实践使得伯豪生物跻身基因编辑领域前沿位置。
由于lncRNA比较复杂，根据位置关系与本底基因有以下几种方式： 
小友提示：如图所示lncRNA（绿色）与本底基因（紫色）的位置关系，其实也是lncRNA的来源问题。 结合我们上文提到的Intergenic和Bidirectional，您发现他们与其他lncRNA的区别了吗？ 因此，对于Sense、Antisense、 Intronic这三种lncRNA，如果基因组水平删除lncRNA，可能会导致本底基因的蛋白功能失活。而对于其他两种lncRNA中，有不少lncRNA虽然cDNA片段只有1-2kb，但实际在基因组中的位置可能跨度达10kb-200kb。因此，CRISPR对于这种大片段的删除效率（实际是NHEJ修复效率）在我们以往的实践经验中并不是特别高。
因此，科学家改进了CRISPR/Cas9技术，首先将Cas9蛋白核酸酶活性中心的关键氨基酸残基（D10与H840）同时突变成丙氨酸残基而获得了没有核酸酶切割活性的突变体dCas9，接着把Kox1基因的KRAB结构（可以募集多种转录抑制因子）克隆在dCas9的3’端，这种既发挥sgRNA识别DNA，并牵引KRAB-dCas9复合物到Promoter区域形成空间位阻，又同时招募转录因子共同抑制RNA转录(包括mRNA、lncRNA、某些miRNA家族)的蛋白-RNA复合物，最高可以将靶基因的表达抑制效率提升至90%左右（伯豪之前的实验数据可以达到95%），这种技术就是CRISPR Interference。
关于CRISPR interference相关的文章陆续登载在Science、PNAS、Cell、Cell Stem Cell等杂志。 CRISPR Interference应用文章
最新发表于2016年的 Cell Stem Cell 杂志显示，来自加州大学旧金山分校的科学家将CRISPRi应用于人 iPSC细胞中可以特异，并可逆的抑制基因转录（链接: https://pan.baidu.com/s/1c2xgs9M 密码: tds8）。
 
图B中，加入Doxycycline 诱导后（原文将CRISPR interference改造成Doxycycline 诱导性表达），CRISPR interference对OCT4、SOX2等基因的表达显著降低了90%以上。 牛津大学Ji-Long Liu教授应用与果蝇lncRNA敲降的研究中（链接: https://pan.baidu.com/s/1o86pxhS 密码: 2eh8），将CRISPR interference系统导入果蝇体内，并分别获得了roX1 与roX2两条lncRNA表达抑制的个体。抑制率分别为78%与83%。
德国癌症研究中心的Sven Diederichs教授发表在Nucleic Acids Research文章在对著名的HOTAIR研究时（链接: https://pan.baidu.com/s/1kUIW3Gz 密码: ufzw），由于HOTAIR定位于细胞核中，通过siRNA 并没有获得比较理想的敲降效果，但CRISPR interference却可以将HOTAIR比较显著的抑制掉： 加州大学Daniel A. Lim教授发表在Genome Biology的Single-cell analysis of long non-coding RNAs in the developing human neocortex文章（链接: https://pan.baidu.com/s/1slpUorj 密码: 82zp）对在大脑皮质中特异表达的LOC646329 进行研究时，LOC646329 的CRISPR interference载体转入U87胶质瘤细胞之后，随着时间的推移，长链非编码RNA LOC646329的表达不断被显著的抑制。
2016年12月15日在线发表在Science期刊上，论文标题为“CRISPRi-based genome-scale identification of functional long noncoding RNA loci in human cells”的研究（链接: https://pan.baidu.com/s/1hs61CH2 密码: kee2）得到了科研界的广泛回应，加州大学旧金山分校神经科学家Daniel Lim构建了1.6万条lncRNA的筛选文库，平均每条lncRNA设计了10条sgRNA靶向TSS区域（转录起始），并转入7种不同的细胞系：iPSC、MCF7、U87、K562、MDA-MB-231、HeLa、HEK293T：
最终筛选到与细胞生长相关的499条 lncRNA。同时也再次证实：尽管基因在不同细胞中执行同一个功能，但在某种细胞（如iPSC）中发挥至关重要的lncRNA集合，很少会在其他细胞中同时表达。因此，lncRNA在某种程度上也充当对细胞特异性塑造的功能。这一研究再次拓展了科学家对lncRNA功能解析的探讨。
图A再次正式了随着时间的推移，lncRNA的表达受到了CRISPR interference系统的显著抑制。图E、F是U87 and HeLa 细胞的LINC00263 敲降效果检测 伯豪基因编辑CRISPR Interference经典案例
CRISPR Interference的敲降效果已经得到了诸多大牛实验室的青睐，伯豪生物正是沿着这一思路，独自改造了这一系统，将载体变的更小，更易于进入到比较难转染的细胞中，在之前的试验项目中，我们针对某个核内lncRNA也设计了一系列的sgRNA，并在特异表达的细胞中验证了敲降效率：*P = 0.00002351。
小友总结：您现在应该能明白了开头的：不成功不收费了吧，其实最核心的原理是lncRNA的表达必须依赖promoter与转录起始因子，因此，当我们找到promoter之后，用CRISPR Interference锚定promoter区域即可实现稳定的敲降。
但还有问题，如果我研究的lncRNA是属于Sense、Antisense、 Intronic这三种咋整？呵呵呵，其实。。。。我们还有其他的办法。。。。。欲知详情，且听下回分解。。。。如果等不到下回，请发邮件至：geneediting@shbiochip.com，小友在此恭候！
伯豪生物十多年的大项目研发经验在攻克了最难的环节时，我们也将普通基因过表达、常规siRNA敲降抑制、miRNA过表达与抑制、环状RNA过表达与抑制等常规细胞培养技术服务列入2017年常规技术服务体系，并结合我们在国内非常有竞争力的高通量测序、基因芯片等业务，一起为您提供更多技术支持！
参考文献：
Brockdorff N, et al. The product of the mouse Xist gene is a 15 kb inactive X-specific transcript containing no conserved ORF and located in the nucleus. 1992. Cell. 71(3): 515-526. Okazaki Y, et al. Analysis of the mouse transcriptome based on functional annotation of 60,770 full-length cDNAs. 2002. Nature 420: 563-573.
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