Plant Cell: 北京大学研究团队在植物m6A研究方面取得重要进展

昵称49849577 2017-12-02

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编者按：最近一段时间，有关N6-甲基腺嘌呤（m6A）修饰的相关研究可以说是当前整个生命科学领域最热门的方向之一，亮点文章频出，着实让人有些目不暇接。这些工作主要涉及m6A在果蝇性别决定、调节斑马鱼母源mRNA清除、小鼠精子发生、T细胞稳态调控、造血干细胞发育以及抗病毒天然免疫中的重要作用。在高等植物中，对这一转录后修饰的研究主要集中于其甲基转移酶复合物（MTA，MTB，FIP37，VIRILIZER，HAKAI等），然而，这一修饰在高等植物中是否是动态可逆的尚不确定。11月27日，北京大学化学与分子工程学院何川/贾桂芳课题组在The Plant Cell杂志发表了题为“ALKBH10B is An RNA N6-Methyladenosine Demethylase Affecting Arabidopsis Floral Transition”的研究论文。该研究发现ALKBH10B是拟南芥中mRNA的N6-甲基腺嘌呤去甲基酶，并通过调控FT、SPL3、SPL9等基因的mRNA稳定性影响拟南芥由营养生长向生殖生长的转变。

论文解读

N6-甲基腺嘌呤（m6A）是mRNA上最丰富的修饰，遍布于真菌，动物以及植物当中。这一修饰调控了mRNA的剪接，出核转运、降解，以及翻译过程，并深刻影响了干细胞状态维持和分化、癌症的发生与发展、动植物生殖与发育、病毒的侵染与扩增乃至果蝇的性别决定等过程。在哺乳动物中，N6-甲基腺嘌呤由甲基转移酶复合物（包括METTL3，METTL14，WTAP，KIAA1429，RBM15等）引入，由去甲基酶（FTO，ALKBH5）去除，并由N6-甲基腺嘌呤结合蛋白识别并发挥功能。在高等植物中，对这一转录后修饰的详细研究主要集中于其甲基转移酶复合物（MTA，MTB，FIP37，VIRILIZER，HAKAI等），然而，这一修饰在高等植物中是否是动态可逆的尚不确定。

人和拟南芥中AlkB家族蛋白的亲缘关系

在该研究中，通过序列比对，研究者发现了拟南芥中N6-甲基腺嘌呤修饰潜在的去甲基酶，并着重研究了ALKBH10B的去甲基功能及其在拟南芥生命活动中的调控作用。

LKBH10B在体外/体内的去甲基作用，（B）中H366A/E368A是ALKBH10B的活性位点突变，该突变的蛋白完全丧失了m6A去甲基功能

研究者首先在体外表达纯化得到ALKBH10B蛋白。ALKBH10B对单链短RNA和全长的拟南芥mRNA都有明显的m6A去甲基活性。通过比较野生型Columbia-0，ALKBH10B的T-DNA插入突变体，突变体回补和无活性回补株系，以及ALKBH10B过表达株系mRNA中m6A的含量，表明ALKBH10B的去甲基功能影响了拟南芥mRNA的m6A水平。

alkbh10b突变体的晚花表型

进一步研究发现，ALKBH10B缺失导致幼苗时期叶片生长速率减慢以及晚花等表型。文章着重阐述的ALKBH10B缺失导致晚花的机理。在ALKBH10B缺失时，FT的mRNA的甲基化水平升高，而相应地，其mRNA稳定性也较野生型Columbia-0更低，最终导致FT的mRNA水平在alkbh10b-1突变体中显著低于野生型Columbia-0。同样，FT上游的SPL3和SPL9也在alkbh10b-1突变体中也有更高的mRNA甲基化水平，更快的mRNA降解和更低的mRNA水平。由此确证ALKBH10B通过影响FT，SPL3和SPL9影响拟南芥的成花诱导。RNA免疫沉淀实验证实，ALKBH10B蛋白与FT，SPL3和SPL9的mRNA有着直接的相互作用，进一步证实了ALKBH10B调控成花诱导过程的机制。

AALKBH10B调控成花诱导过程的机制

最后，本文分别对野生型Columbia-0和alkbh10b-1突变体进行了RNA-seq和m6A-IP-seq。测序结果表明，ALKBH10B广泛影响了拟南芥mRNA的甲基化谱。相较于m6A peaks整体的分布，在alkbh10b-1突变体中高甲基化的peaks更倾向于分布在CDS区。m6A保守序列模式分析显示，ALKBH10B对靶标的选择性并不来自其序列选择性。对覆盖突变体中高、低甲基化peaks基因的功能注释显示，ALKBH10B缺失影响的基因功能与所观察到的alkbh10b-1突变体表型相吻合。作者还分别用位点特异性剪切放射性标记薄层层析法以及m6A免疫沉淀定量PCR法对所测得的高甲基化peaks进行了检验。结果表明，本文m6A-IP-seq具有很好的准确度和稳健性。

覆盖高甲基化m6A peaks基因的功能注释

自人体中第一个N6-甲基腺嘌呤去甲基酶FTO的发现起，这一RNA转录后修饰得到了越来越广泛的研究。这一工作确证了在高等植物中N6-甲基腺嘌呤同样是动态可逆的。与哺乳动物类似，高等植物的m6A去甲基作用同样影响了生殖过程，以及营养生长过程。这一工作揭示了高等植物生命活动调节中一个尚不为人所知的层面，也为该领域后续的研究提供了新的范式。