|
先吐槽 ~ 小伙伴儿要求讲：ATAC-seq能用来解决什么样的问题？ 好吧！小丫整理了研究策略干货贴：《老板让找DNA转录调控分子，这个技术十拿九稳》。 小伙伴儿又嫌干货太干，要有文章有例子。 好吧！结合文献：《表观基因组更稳定更长寿 | 这个问题是否跟表观遗传有关？先做个ATAC-seq再说》 小伙伴儿又嫌ATAC-seq出场时间太晚。 于是，找小丸子推荐paper。 小丸子你是跟我有仇吗？老板说不用解读全文，只要解读带ATAC-seq的Figure就好。这篇每张Figure都带ATAC-seq（帮我找个怒吼带回音的表情）！！！ 仔细一看才发现，这篇简直发挥了ATAC-seq的所有特长！ 分享上个月发表在eLife上的一篇文章 Chromatin accessibility underlies syntheticlethality of SWI/SNF subunits in ARID1A-mutant cancers. （Elife, 2017Oct 2, IF=8.6） 陈述现象：
提出问题：
解决方案 思路大白话 Q：从何处入手？用啥材料？ A：有对比才有发现。两个基因分别KD或KO，再一起KD或KO，加上对照组。 Q：做啥实验？这俩基因KD/KO一定会引起表观调控的变化吗？那么多组蛋白修饰，做哪个的ChIP-seq？ A：先做个ATAC-seq，就当预实验了，check一下基因KO/KD是否引起了表观基因组水平上的变化。 Q：发现开放染色质发生了剧烈变化（Fig.1），这“预实验”发现的特征有点多。继续问：什么地方变了？ A：做几个经典的组蛋白修饰的ChIP-seq，结合已发表的GRO-seq数据，发现这俩基因跟enhancer活性及其相关的histone mark有关（Fig.2和3）。 Q：既然能跟enhancer扯上关系，那么具体是哪个TF结合了这些区域，从而行使了远距离调控的enhancer功能呢？ A：祭出神器：ATAC-seq + motif，在ATAC-seq标出的差异开放区域上，找到了AP1家族转录因子的motif（Fig.4）。用已发表的AP1家族成员ChIP-seq数据验证。 Q：2个基因 + enhancer + AP1，这么丰富的调控机制，影响基因表达了吗？调控了哪些生物学通路呢？ A：RNA-seq出场，结合已发表的PolII的ChIA-PET数据，发现是因为形成了loop从而影响下游基因表达。下游基因富集在重要的癌症相关生物学通路上（Fig.5和6）。 Q：这只是在一个细胞系里发现的规律，是否具有普遍性？ A：拿另一种癌症的细胞过来验证，只做其中一个基因的ATAC-seq、ChIP-seq和RNA-seq，就看到了同样的规律。说明该作用机制具有普遍性，意义更重大。 下面是详细的图和结论： 材料：结直肠癌细胞HCT116、ARID1A KO、ARID1B KD、ARID1A KO且ARID1B KD 方法：ATAC-seq，H3K4me1、H3K4me3、H3K27ac、H3K27me3的ChIP-seq，RNA-seq 这篇文章产生了这么多数据： 还加入了这么多已发表的公共数据，DNase-seq，SMARCA4、SMARCC1、FRA1、JUND、CTCF、ATF3的ChIP-seq，POL2RA的ChIA-PET，GRO-seq： Fig. 1 ARID1A and ARID1B have unique and shared roles in the maintenance of chromatin accessibility.用ATAC-seq看开放染色质，用来衡量SWI/SNF的染色质重塑活性。发现：ARID1A KO会引起染色质开放性剧烈变化，ARID1B KD就没反应；在ARID1A KO细胞里KD ARID1B，会进一步改变“依赖于ARID1A区域”的开放状态。这解释了为什么这俩基因合成致死。ARID1A蛋白比ARID1B含量高很多，说明ARID1A更多的参与形成SWI/SNF复合物，这部分解释了为什么癌症中更常出现ARID1A突变。Fig. 2 Requirement for ARID1A or ARID1B is determined by SWI/SNF complex occupancy ARID1A？还是ARID1B？由SWI/SNF复合物定位在哪里来决定。解释了为什么ARID1A和ARID1B互斥出现在SWI/SNF复合物里。 Fig. 3 ARID1A/1B-dependent accessible sites are primarily located in enhancers ARID1A/1B are necessary to maintain active enhancer architecture 依赖于ARID1A和ARID1B的开放区域有着高水平的SMARCA4和SMARCC1结合，很强的H3K4me1和H3K27ac富集，借助已发表的GRO-seq数据发现这些区域转录出很多enhancerRNA，这些说明ARID1A/B的缺失通过影响enhancer活性来影响开放性。Fig. 4 ARID1A/1B are required for binding of AP-1 complex family members 前面的ATAC-seq发现了那么多差异的开放区，通过分析motif，发现了多个AP-1家族成员的motif。借助这些家族成员的已发表的ChIP-seq数据，验证了这一发现。并且发现他们结合在enhancer上，需要ARID1A和ARID1B的参与。Fig. 5和6 ARID1A and ARID1B regulate gene expression by maintaining active enhancer architecture ARID1A/1B maintain transcription of genes in cancer growth promoting pathways, including MET 上述依赖于ARID1A和ARID1B的开放区变化影响了哪些基因表达？借助已发表的PolII的ChIA-PET数据，结合RNA-seq分析发现，依赖于ARID1A和ARID1B的开放区和enhancer上的H3K27ac，是通过在TSS区跟其他调控区形成loop，来影响基因表达。ARID1A和ARID1B缺失带来的这些改变带来的差异表达基因，富集在细胞生长和粘附信号转导通路中，包括驱动细胞增殖的MET。而且在MET基因及其下游发现了大量AP1复合物和SWI/SNF复合物。这些结果表明，SWI/SNF复合物在维持转录因子结合的开放区和活跃enhancer的组蛋白mark上起着重要作用。缺少SWI/SNF复合物会导致这些过程失调，改变癌症通路中关键基因的表达。这与ARID1A和ARID1B缺失所导致的癌细胞生长减缓的现象一致。Fig. 7 ARID1B regulates accessibility and active histone modifications at enhancers in ARID1A mutant ovarian cancer cells 用相似的技术在自然发生ARID1A突变的卵巢癌细胞系里KD ARID1B，观察到的现象与上述HCT116中的一致。说明这是多种癌症类型共有的普遍调控机制。
结论：该研究阐明了ARID1A和ARID1B在维持染色质开放性中的功能，确定ARID1A及其合成致死基因ARID1B通过调控核小体重塑，从而发挥抑癌作用。 |
|
|
