生存相关的选择性剪接事件

非小细胞肺癌中的预后选择性mRNA剪接特征

背景

蛋白质多样性对于在真核细胞中产生显著的调节和功能复杂性是至关重要的。pre-mRNA的选择性剪接是用有限的一组基因产生mRNA异构体的普遍机制。选择性剪接是大多数人类多外显子基因的内含子被删除，特定的外显子被选择性地包括或排除在外的过程。除了蛋白质多样性之外，还通过引入导致降解的提前终止密码子的选择性剪接来调节mRNA异构体的翻译降低。 因此，选择性剪接是一个重要的过程，剪接模式的变化与蛋白质功能密切相关。

肺癌是最常见的癌症事件，也是中国和世界范围内癌症死亡的主要原因。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌最常见和异质性的亚型，包括肺腺癌（LUAD）和肺鳞状细胞癌（LUSC）。然而，与其他基因组数据，如拷贝数变异，DNA甲基化和基因表达不同，尽管其在癌症中发挥重要作用，但仍缺乏系统分析选择性剪接的方法。癌症患者选择性剪接的全基因组谱分析，特别是非小细胞肺癌中，仍十分匮乏。

癌症基因组图谱（TCGA）项目为调查癌症中的选择性剪接模式提供了丰富的资源。外显子，剪接和转录本异构体表达水平可从TCGA Data Portal获得。本文系统地分析了TCGA中491个LUAD和471个LUSC队列中的全基因组选择性剪接事件，发现了一些生存相关的选择性剪接事件。更重要的是，LUAD，LUSC和合并的NSCLC患者的预后预测因子的构建具有高性能，并在LUAD和LUSC中发现了可能是潜在机制的有趣的剪接网络。

数据

TCGA数据库中LUAD和LUSC患者的RNA-seq数据和用于生存分析的患者的临床信息。

结果

1、整合LUAD和LUSC患者的mRNA选择性剪接事件谱

对TCGA的491例LUAD患者和471例LUSC患者深入分析整合的mRNA剪接事件谱。使用SpliceSeq工具分析mRNA剪接模式，选择性剪接事件包括七种类型，Exon Skip (ES), Mutually Exclusive Exons (ME), Retained Intron (RI), Alternate Promoter(AP), Alternate Terminator (AT), Alternate Donor site (AD)和Alternate Acceptor site (AA).

 

在LUAD中，在10367个基因中检测到45062个mRNA剪接事件，其中在6075个基因中包含17903个ES，在1585个基因中包含2781个RI，在3304个基因中包含8993个AP，在3407个基因中包含8549个AT，在1995个基因中包含3057个AD，在2302个基因中包含3559个AA，在202个基因中包含220个ME; 在LUSC中，在10558个基因中检测到50732个mRNA剪接事件，其中包括6638个基因中的22737个ES，1757个基因中的2862个RI，3598个基因中的9302个AP，3591个基因中的8581个AT，2200个基因中的3263个AD，2559个基因中的3752个AAs和215个基因中的235个ME。

LUSC中的选择性剪接事件比LUAD中的更加频繁。这些结果还表明，一个基因可能有几种类型的mRNA剪接事件，ES是主要的类型，将近一半的选择性剪接事件是ES事件。

2、LUAD和LUSC中生存相关的选择性剪接事件

在研究mRNA剪接事件的预后价值之前，进行了单因素生存分析以评估临床参数与LUAD和LUSC结局的关系。在LUAD队列中，T分期，N分期和TNM分期显著与OS相关; 在LUSC队列中，M分期与OS显著相关。这个初步评估的结果表明生存数据是有信息量的并且是适当的用来进行进一步的分子研究。

然后对LUAD和LUSC队列中的选择性剪接事件与OS的关联进行了详细研究。分别使用LUAD和LUSC队列中的可变剪接事件进行单变量生存分析。结果发现LUAD和LUSC分别有3691个和2403个生存相关的选择性剪接事件（P <>

 

注意到一个基因可能有两个或两个以上与患者生存显著相关的事件。 因此，生成了UpSet图，一个更加可扩展的替代Venn图的用于可视化交集的图。有趣的是，一个基因可能有多达四种与患者存活显著相关的选择性剪接事件。

  

将LUAD和LUSC中最显著的生存相关基因导入cytoscape产生基因相互作用网络。基因网络的分析揭示了重要的癌症途径。

  

3、LUAD和LUSC患者的预后预测因子

作者选择了七种类型中最重要的生存相关的选择性剪接事件作为候选。为了消除预后基因模型中可能不是独立因素的事件，分别对七种类型的候选剪接事件应用多变量Cox回归模型。

独立的预后选择性剪接事件被进一步分析来建立LUAD和LUSC的最终预后预测因子。 ROC曲线也被用来比较这些预后模型的效率。最终预后预测因子确实在区分患者的良好或较差生存方面表现出更好的表现（图5）。ROC曲线证实最终的使用所有类型可变剪接预测因子具有最高的效率，与在特定类型的可变剪接上构建的其他模型相比。

 4、NSCLC患者的预后预测因子

为了构建适用于非小细胞肺癌患者的预后预测指标，在临床实践中更容易和更有价值，选择了LUAD和LUSC队列中重叠的生存相关的选择性剪接事件（P <>

这种预后预测因子在NSCLC和LUAD或LUSC中都表现良好。在非小细胞肺癌患者中的ROC曲线下面积为0.817，略低于LUAD（AUC = 0.820），略高于LUSC（AUC = 0.813）。虽然这个预后预测因子与LUAD和LUSC特异性模型（0.817 vs. 0.940和0.960）相比稍弱一些，这一预后指标在临床实践中仍具有很大的应用潜力。

5、生存相关的选择性剪接事件网络

接下来，分别对LUAD和LUSC中194个和327个最显著的生存相关的选择性剪接事件的剪接调控网络进行了表征。具体而言，作者考察这些选择性剪接事件中是否有很大一部分可能受到NSCLC组织中表达改变的一些关键剪接因子的调控。使用TCGA中LUAD和LUSC 的level 3的RNA-seq数据计算的基因表达水平，鉴定了在LUAD和LUSC中基因表达水平与OS显著相关的51和11个剪接因子。

此外，生存相关剪接因子的基因表达水平与生存相关的剪接事件的PSI值之间的相关性通过Spearman方法进行计算。相关网络被构建，且只有显著的相关性被展示。在LUAD的相关网络中，49个生存相关剪接因子（紫色点）的表达与75个生存相关的选择性剪接事件显著相关，其中37个与患者的良好存活（绿点）显著相关，而38个与患者存活率差显著相关（红点）。在LUSC相关网络中，9个生存相关剪接因子（紫色点）的表达与75个生存相关的剪接事件显著相关，其中29个与患者良好生存显著相关（绿点），46个与患者存活率差显著相关（红点）。

6、癌症特异性和临床分期相关的选择性剪接事件

虽然本研究主要集中在非小细胞肺癌预后相关的选择性剪接事件，LUAD和LUSC癌症特异性和临床分期相关的选择性剪接事件也被分析，以提供异常选择性剪接的概述和重要的附加信息。与正常对照相比，LUAD和LUSC中分别有9284和13290个差异剪接的选择性剪接事件。此外，在LUAD和LUSC中，数十至数千个选择性剪接事件与临床分期（包括T分期，N分期和M分期）显著相关。许多这些异常的选择性剪接事件也与患者的总生存相关。例如，与正常对照相比，LUAD和LUSC中差异性剪接的CHCHD7是NSCLC患者预后的独立因子。

总结

尽管检测患者事件的能力有限，本文发现了生存相关的选择性剪接事件可以用来构建NSCLC中高性能的风险分层的预后预测因子，这在临床实践中是有前景的。此外，本文还在LUAD和LUSC患者中发现了独特的剪接相关网络。这些结果对于揭示RNA剪接在非小细胞肺癌发生中的功能贡献将是最有价值的。RNA剪接模式的深入分析可能确实揭示了新的癌症驱动因素，并提供了这些途径的机制见解。

参考文献

Li Y, Sun N, Lu Z, Sun S, Huang J, Chen Z and He J. Prognostic alternative mRNA splicing signature in non-small cell lung cancer. Cancer letters. 2017; 393:40-51.

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