1. 中医与中药概述
中医是伪科学吗？若不是，她能否与现代科学实验结合？中医与中药有什么关系？中药为什么能治病？到底是什么物质在其作用？下面我们将带领你一起揭开她几千年的神秘面纱。
说起中医这个话题，我想首先映入大家脑海的印象大都是望闻问切、针灸、推拿、以及具有多种奇特功效的中药。不论是在学术界还是普通大众之间谈论这个话题历来都是神秘而又充满争议的。说它很神秘，甚至可以说是玄幻，因为关于它的真相就像罩着一层神秘面纱，难以企及，很大一部分原因在于中医基础理论晦涩难懂；说其一支具有争议性，主要在于目前中医的临床治疗效果是毁誉参半，难以量化、重复性较差、没有标准等是其主要症结所在。
提起中药大家应该都耳濡目染，不过很少有人知道它确切含义，常常把天然产物与中药混淆在一起。根据经典定义，中药是在中医基础理论指导下使用的一类药物，其来源主要包括植物药、动物药及少部分矿物质。常见的如人参、杜仲、大枣、地黄、鹿茸、雄黄等。
目前临床上应用的药物三分之一以上直接来自于天然产物，或以天然产物的活性成分为先导结构而发展的衍生物、类似物或全合成化合物3。中药作为一类重要的天然药物4，因其较低的毒副作用、丰富的天然资源、独特的治疗效果、不易产生耐药性等特点一直受到国内外学者的关注4,5。
中药活性成分如黄酮、生物碱、萜类、香豆素、蒽醌等大都具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化等多种生物活性，具有极高的临床应用价值。虽然关于中药生物活性研究的报道较多，然而，大多数中药化学成分复杂，药效成分的体内吸收、分布、代谢途径不清，同时又具有“多重靶标”特性，使得其作用机制研究严重滞后，限制了中药的进一步开发与应用。
基于软电离技术的质谱分析因具有灵敏度高、耗样量少、分析速度快、化学特异性强等优点，已成为药物靶标定性定量研究的强有力工具，在中药活性分子作用机理研究，特别是药物靶标鉴定中受到越来越多的重视。
药物靶标是药物发挥治疗作用，实现其临床疗效的生物大分子或特有的生物大分子结构域。而蛋白质是最重要的药物作用靶标，同时我们也知道蛋白质是生命活动的执行者，因而中药作用靶标蛋白质的发现对于中药作用机理的阐明，基于靶标的药物合理设计具有及其重要意义，特别是从物质层面（分子水平）部分揭示了中医有效的本质，这也只是中医有奇效神秘面纱下的一角，其他诸如活性分子的信号转导通路，靶标蛋白质互作网络，经络传导通路等将是一座达芬奇密码金字塔，等待更多能人去探宝。
本文余下总结、评述近年来采用基于质谱的蛋白质组学技术鉴定中药活性成分靶标蛋白质的研究进展，旨在阐述现代科学技术（质谱技术）研究中药活性成分作用机理的基本策略以及取得的成果，以期进一步推动生物质谱技术在中药现代化研究领域中的应用。
2. 中药及其活性成分
中药是在中医基础理论指导下用于预防、诊断、治疗疾病或调节人体机能的药物，在中国具有两千多年的应用历史，其来源包括天然植物、动物、矿物。中药根据其功能分类，一般可以化分为解表药、清热药、化痰止咳平喘药、祛风湿药、活血化瘀药、芳香化湿药、泻下药、安神药、补益药、利水渗湿药、消食药等。中药在临床治疗中以其多靶点、毒副作用低、不易产生耐药性、通过调节人体整体功能而发挥作用的特点已在长期的临床实践中显示出独特的优势。然而，目前中药研究存在的普遍问题是化学成分复杂，中药材质量控制标准难以统一，药物在体内吸收、分布、代谢途径多数不明确，药物作用物质基础不清，分子靶标难以明确等。
上世纪90年代罗国安等6提出“以现代科学技术切入中药现代化”的策略，随后1997年提出“中药复方有效组分理念及研究方法”7，1999年王永炎院士领衔的中医学界第一个国家重大基础研究计划（“973”）项目“中药方剂关键科学问题的基础研究”启动，逐渐兴起了中药现代化的研究热潮8。王永炎、张伯礼等提出中药方剂的发展方向是组分中药，即采用现代技术手段研究中药的化学成分，明确其活性成分及其作用机制，促进中药进一步的临床应用9-11。
中药活性成分是指中药提取物中，在疾病的诊断、治疗、症状缓解或疾病预防中具有药理活性或其它直接作用，或者能影响机体功能的化学物质。根据中药的定义，中药来源主要包括植物、动物及少部分矿物质。中药在临床应用中大多使用复方，即将不同来源的药材遵循特有的理法方药理论，按照君臣佐使配伍使用。其中植物药材占大多数，小部分来源于动物组织或者脏器，或加工过的矿物质。来源于药用植物的中药活性成分主要包括黄酮、多糖、挥发油、生物碱、甾体、皂苷、萜、脂肪酸和酚酸等，是中药发挥其药效作用的物质基础。
3．药物靶标及其鉴定方法
药物靶标是指存在于组织细胞内与药物分子具有特异性相互作用，并能使药物发挥其预期生物活性的生物分子，95%以上为蛋白质，包括酶、受体蛋白质、离子通道蛋白质、调节因子、核受体等2。
药物靶标蛋白质的鉴定既是药物研发的关键科学问题，也是化学生物学，特别是化学基因组学研究中最具挑战性的前沿科学问题12,13，由此催生了许多由现代分析技术派生的药物靶标蛋白鉴定新方法和新技术，其中化学蛋白质组学是发展较为成熟、应用最为广泛的药物靶标蛋白鉴定技术14-16。针对药物靶标蛋白鉴定的化学蛋白质组学研究主要有两种策略：即活性蛋白质谱（activity-basedproteinprofiling, ABPP）技术和以小分子化合物为中心的化学蛋白质组（compound-centricchemical proteomics，CCCP）技术16。由BenjaminF Cravatt等发展和建立的ABPP技术最初是采用定向活性位点的化学探针监测复杂生物体系中一组或几组生物酶的活性，揭示在病理、生理过程中酶的生物功能17。ABPP技术应用于药物靶标蛋白鉴定时，药物分子通过化学修饰与荧光基团或生物素分子联接，构建能直接与潜在的靶蛋白共价结合，或基于光交联反应与靶蛋白共价结合的化学探针。化学探针与细胞裂解液或全蛋白提取液孵育后，与探针共价结合的蛋白质复合物通过凝胶电泳或亲和色谱技术分离富集后进行鉴定16。CCCP技术同样由靶标蛋白分离和鉴定两个步骤构成。靶标蛋白分离富集方法主要包括光催化亲和微球技术18、琼脂糖亲和微球技术19、靶标垂钓技术（fishing-rodstrategy）12,20等。这类亲和分离技术的核心是将与小分子药物化学结构类似，或直接通过化学修饰获得的药物分子衍生物通过共价结合方式固定在固体基质（如磁性微球或琼脂糖微球）上构建药物分子亲和探针19,21,22;然后，将亲和探针与细胞裂解液或细胞全蛋白提取液孵育，捕获能与药物分子相互作用的蛋白质（靶标蛋白）；最后，采用离心分离或磁分离,洗脱后进行鉴定（下图所示）。无论是ABPP还是CCCP技术，药物靶标蛋白的鉴定则以基于质谱的蛋白质组学技术最为常见。
质谱，顾名思义就是将样品转化为运动的气态离子，经过质量分析器后按质荷比(m/z)大小排列获得的谱图，相应的技术及仪器分别称为质谱技术、质谱仪。质谱仪一般由进样系统、离子源、质量分析器、检测器及数据处理系统等五个部分组成。上世纪80年代后期以电喷雾电离（Electronspray Ionization，ESI）和基质辅助激光解吸/电离（Matrix-AssistedLaser Desorption/Ionization，MALDI ）为代表的软电离技术的出现，使与生命活动密切相关的分子，如蛋白质，多肽，DNA等的质谱分析成为可能，由此诞生了生物质谱这一新的生物物理技术。
生物质谱鉴定蛋白质和蛋白质复合物的方法主要包括自下而上（Bottom-up）和自上而下（Top-down）两种策略。自下而上方法首先将蛋白质（或蛋白质混合物）酶解成肽段，经纳升液相色谱分离后导入质谱仪进行一级质谱/二级质谱分析，然后结合数据库检索鉴定蛋白质序列。自下而上质谱分析是蛋白质组学研究中较为成熟的大规模蛋白质鉴定技术24；自上而下方法则将完整的蛋白质（或蛋白质混合物）经过液相色谱分离或直接引入质谱仪进行二级（或多级）质谱分析，鉴定蛋白质序列，其优势在于可对蛋白质的翻译后修饰以及大规模蛋白质异构体进行精确的测序分析25，其挑战之处是大分子量蛋白质的二级质谱数据解析困难。鉴于此，middle-down技术应运而生，即将大分子量蛋白质通过限制性酶解水解为几条分子量相对较小的大肽，然后通过对大肽的二级或多级质谱分析鉴定蛋白质序列26。药物靶标蛋白的鉴定方法以自下而上的质谱分析更为常见27。
基于质谱的化学蛋白质组学技术鉴定小分子药物靶标蛋白的最大优势是质谱分析的对象源自特定细胞群（如某一亚型的肿瘤细胞）的全体天然蛋白质，包括所有丰度水平的内源性蛋白和其翻译后修饰亚型、天然结合伴侣，以及与疾病相关的基因突变体等，这使得质谱分析获得的结果能尽可能客观的反映药物与蛋白质相互作用的真实环境。但是，细胞全蛋白质提取液的复杂性，加之以药物分子（或其类似物）构建的亲和探针对蛋白质的非特性吸附，使质谱分析的背景信号较高，而且质谱定性分析不能区分与药物分子直接结合和间接结合的蛋白质。我们的策略是在构建药物分子亲和探针（即阳性探针）的同时，构建不含药物分子（或诱饵基团）的阴性探针。然后，将阳性探针和阴性探针从等量全蛋白提取液中捕获的蛋白质分别酶解，并以轻重同位素试剂标记，等量混合后进行质谱相对定量分析，这样可以很好地消除亲和探针与蛋白质的非特异性结合带来的假阳性结果20,21。
4．中药活性成分靶标蛋白质的鉴定
近年来，随着中药现代化研究的深入，以及化学蛋白质组学和化学基因组学等相关技术的日趋成熟，已有多个典型的中药活性成分单体，如三氧化二砷9,10、青蒿素28-30等的作用靶标被成功鉴定。结合系统生物学和生物信息学技术，化学蛋白质组学技术也被应用于中药复方活性成分的蛋白质靶标鉴定和研究。如陈竺，陈赛娟等10通过化学蛋白质组学的方法揭示了复方黄黛片在治疗急性早幼粒细胞白血病（AcutePromyelocyticLeukemia，APL）时的多靶点协同效应的机制。Li等31采用多组学技术研究补肾益肺方治疗慢性阻塞性肺病（COPD）的分子机制，发现补肺益肾方同样是通过对脂代谢、氧化应激、细胞连接和炎症响应等多个信号通路的调节作用发挥其药效作用。但是，鉴于中药复方靶标蛋白质鉴定的复杂性和不确定性，中药活性成分靶标蛋白质的鉴定以针对结构确定的单体成分的研究为主。根据中药的组成特点，我们将根据中药活性成分化学结构特征分别对其药物靶标蛋白鉴定的研究进展进行简要概述。
4.1 黄酮类活性成分靶标蛋白质的鉴定
黄酮类活性成分是指该类化合物基本母核为2-苯基色原酮，且其中两个苯环通过碳原子连接，基本骨架为C6-C3-C6。黄芩是临床中广泛使用的一种传统中药，主要含有黄芩素、汉黄芩素、黄芩苷和汉黄芩苷等黄酮类活性成分32。研究表明，黄芩具有抗菌、利尿、抗炎、解热、抗病毒以及抗肿瘤等多种生物活性33-37。Han等38研究发现黄芩苷通过抑制PDGFR-ERK信号通路，增加p27蛋白质表达，进而阻止血管内膜增生造成的损伤。迄今为止，已有多篇关于黄芩苷38-40和黄芩素41与特定蛋白质之间相互作用的研究报道。Young等采用基于质谱的化学蛋白组学方法研究黄芩苷在脂多糖诱导的鼠炎症反应作用的蛋白质组，发现黄芩苷通过作用于多种蛋白质发挥治疗作用，其中ANXA2等可能是黄芩苷抗炎作用的靶标39。Dong等40研究发现黄芩苷通过诱导蓖麻毒素蛋白质形成多聚体，抑制蓖麻毒素对小鼠的毒性。他们进一步的研究表明，黄芩苷上的羟基通过与蓖麻毒素蛋白质上的氨基酸形成氢键，诱导蛋白质形成多聚体，进而降低该蛋白的毒性，达到解除蓖麻毒素毒性的作用。Zhang等42研究发现黄芩苷通过调节SOCS3通路对模型动物自身免疫性脑脊髓炎发挥治疗作用。最近，Dan等43一项关于黄芩苷在治疗皮肤癌作用的化学蛋白质组学研究中，发现黄芩苷可以与核仁磷酸蛋白质发生（Nucleophosmin，NPM）相互作用。NPM1基因沉默显著增强黄芩苷的抗肿瘤活性，提示NPM可能是黄芩苷在癌症治疗中发挥作用的重要靶标。我们课题组基于点击化学反应构建了一种黄芩苷的磁性纳米亲和探针，从人胚肾细胞HEK293全蛋白提取液中捕获蛋白，质谱分析表明黄芩苷能与NPM1特异性结合。我们进一步的定量分析结果表明，除NPM1外，黄芩苷对物质和能量代谢相关蛋白质（细胞色素C、延长因子Tu）、炎症相关蛋白（热休克蛋白质、钙磷脂结合蛋白），以及细胞调亡相关蛋白（Caspase-14）和转录因子（RFA1）等表现出不同的反应活性，与中药活性成分多靶点作用特性相一致21。
4.2苯丙素类活性成分靶标蛋白质的鉴定
牛蒡子属于菊科植物牛蒡子属牛蒡A rctium lappa L，它的成熟果实入药，作为解表药中发散风热的一种中药，主要用于治疗风热感冒、咽喉肿痛、痈肿疫毒等症44。牛蒡子苷及牛蒡子苷元是从牛蒡子中提取分离而来的一类苯丙素类化合物，是牛蒡子中起主要药理作用的活性成分。牛蒡子苷在体内可以转化为牛蒡子苷元，研究表明牛蒡子苷元具有解热、抗菌、抗肿瘤、抗炎等多种药理作用45。Hou等46通过基于UPLC/Q-TOF-MS筛选清肺丸的抗炎活性成分，发现牛蒡子苷元是其中的抗炎活性成分。牛蒡子苷元还能缓解气道收缩、松弛气道平滑肌，Luo等47研究表明牛蒡子苷元主要通过影响钙的跨膜流动发挥药效作用。此外，Hatayama等48研究发现牛蒡子苷元通过抑制热休克转录因子活化的水平以及热休克蛋白的合成，发挥解热作用。虽然牛蒡子的临床应用已有悠久的历史，但是具有多种药效作用的分子机理仍然不是十分明确。针对这一科学问题，Cui等49发展了一种功能化的牛蒡子磁性纳米亲和探针，结合同位素代谢标记技术，应用质谱分析研究发现了牛蒡子苷元的多个潜在靶标蛋白。进一步通过分子对接分析，他们发现牛蒡子苷元抗炎的药效靶标是HSPA8、GAPDH、PPIA等蛋白质。他们的研究还发现，牛蒡子苷元（arctigenin）通过对PDK1/Akt/PDE4D信号通路的调节作用发挥其治疗哮喘的功效50。
4.3 萜类及挥发油类活性成分靶标蛋白质的鉴定
萜类化合物是一类由甲戊二羟酚衍生而成，基本骨架具有两个或二个以上异戊单元结构特征的化合物，主要包括半萜、单萜、倍半萜、二萜、三萜等结构。甘草是临床上具有悠久历史的一味中药，具有皮质激素样的抗炎作用。甘草的主要抗炎活性成分为甘草酸和甘草次酸，甘草酸是一种五环三萜类化合物。Brukart等51采用生物素-链霉亲和素化学标记方法对甘草酸进行标记，采用点击化学的原理在细胞中成功捕获、鉴定了甘草酸的靶标蛋白-蛋白激酶C。葫芦苦素E(Cucurbitacin E)是中药瓜蒂中的主要有效成分，也是一种萜类化合物。Sörensen等52研究表明葫芦苦素E对原发性肝癌有很好的治疗效果，同时对KB及HeLa细胞有很强的细胞毒性。他们通过基于质谱的化学蛋白组学研究发现，葫芦苦素E可以与丝状肌动蛋白中的Cys257特异性结合，表明肌动蛋白可能是葫芦苦素E的作用靶标。
青蒿素是从植物黄花蒿中提取分离出来的一种抗疟活性成分，属于倍半萜内脂化合物。屠呦呦研究员发现青蒿素, 有效降低疟疾患者的死亡率, 由此获得2015年诺贝尔生理学或医学奖53。最近Wang, J和Ismail等分别应用化学蛋白质组学分析技术成功鉴定了124个与青蒿素结合的蛋白，其技术路线如下所示。
他们应用与青蒿素结构和活性相似的衍生物构建分子探针，该探针既可用于细胞成像定位靶标分子在细胞内的分布，也可用作亲和探针捕获青蒿素的靶标蛋白，进行质谱分析鉴定。采用基因本体论（Geneontology，GO）对鉴定的蛋白质的功能分析表明，大部分青蒿素结合蛋白均参与疟原虫的多种生物过程，如羧酸代谢、细胞生物胺代谢、核苷代谢和核糖核苷生物合成等，表明青蒿素是通过与细胞内多种蛋白质的相互作用协同发挥抗疟作用。
此外，Zhou等28研究青蒿素抗肿瘤的靶标时发现，青蒿素同样是通过与细胞内多种蛋白质稳定结合发挥抗肿瘤作用。紫杉醇是一种临床上广泛应用的抗癌药物，是源自红豆杉的一种四环三萜类化合物。Rodi55等利用噬菌体展示技术，筛选紫杉醇的药效靶标，发现紫杉醇基于与Bcl-2蛋白的结合发挥其抗癌作用。青蒿素和紫杉醇等作为中药活性单体开发研究的成功典范，指明了中药现代化研究的一个新方向，即通过对中药活性单体的系统研究，鉴定其作用靶标，明确其药效机制，提升传统中药在临床上的应用。
4.4 生物碱类活性成分靶标蛋白质的鉴定
生物碱是一类含氮的碱性有机化合物,是药用植物中常见的活性成分。常见的生物碱活性成分有喜树碱、长春碱、苦参碱、秋水先碱、麻黄碱等。喜树是一种常用的中药，含有多种活性成分，其中喜树碱是其抗癌的主要活性成分。早期的研究发现喜树碱对DNA以及RNA合成酶具有抑制作用56。随后，Hsiang 等57发现喜树碱主要作用于拓扑异构酶I，通过改变拓扑异构酶I的空间结构，抑制DNA的合成代谢。但是，最近基于质谱的高通量筛选研究发现，喜树碱既不是直接作用于DNA,也不是直接作用于拓扑异构酶I，而是通过与DNA-TopoI复合物作用发挥药效58。苦参是一种来源于豆科植物苦参的常用中药，主要活性成分为苦参碱4。研究发现，苦参碱具有抗肿瘤活性59,通过上调Bax、下调Bcl-2水平，诱导细胞凋亡，发挥抗癌作用60。此外，苦参碱也可通过下调NF-kB 1抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移61。在临床综合化疗中，苦参碱常用作调节剂改善患者生存质量62,63。最近，Chai等64通过光亲和标记结合质谱分析发现，苦参碱在癌细胞中的直接靶标蛋白质可能是膜连蛋白质AnnexinA2。Inn等65利用黄连素衍生物构建亲和探针，从细胞裂解液中捕获黄连素的靶标蛋白，质谱分析发现Actin是黄连素特异性结合的蛋白质。他们进一步的分子生物学和荧光共聚焦成像研究表明，黄连素通过阻止Acting的多聚化，抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。
4.5 矿物类活性成分靶标蛋白质的鉴定
传统中药砒霜（三氧化二砷）在中国具有悠久的应用历史，它是一种矿物质，在中国常被用于治疗急性早幼粒细胞白血病（APL）66,67，临床治疗效果较好，患者五年生存期可达到95%以上。陈竺等对三氧化二砷的分子作用机理进行了深入系统的研究。他们早期的研究表明，三氧化二砷通过提升生长抑制因子PML的类泛素化和降解发挥其抗癌活性68 。他们进一步应用生物质谱分析研究发现，三氧化二砷与PML锌指结构中的半胱氨酸残基结合，诱导PML寡聚化，促进类泛素化蛋白质UBC9与PML的结合，导致PML的类泛素化和降解，破坏癌源融合蛋白PKL-RARa的结构，从而发挥其抗癌药效9。
4.6其他中药活性成分靶标蛋白质的鉴定
Lakshmi Raj等69采用定量蛋白质组学分析研究天然产物菝葜酰胺在癌细胞中的作用靶标，发现荜菝酰胺通过选择性调节癌基因中凋亡蛋白质PUMA的表达，提升活性氧（ROS）的产生，诱导癌细胞凋亡。Wang等70应用分子动力学模拟方法研究发现冬凌草素抗癌的直接作用靶标是热休克蛋白质HSP70。另一种抗癌活性天然产物雷公藤红素发挥抗癌药效的靶标蛋白质被确认为转录因子解旋酶XPB71。此外，Lomenick等72应用DART质谱分析鉴定出白藜芦醇在酵母细胞中能特异性结合eIF4A蛋白质；Lee等研究发现葫芦素的靶标蛋白质为mTOR(34) 73。蟾蜍他灵（gamabufotalin）是从动物蟾酥中分离提取的一种二烯羧酸内酯化合物，被用于多种癌症的辅助治疗中。Zhang等基于稳定同位素标记的定量蛋白质组学研究发现，蟾蜍他灵具有多个潜在的蛋白靶标，其中HSP90是其蛋白质作用网络的中心。进一步的分子对接和动物实验研究证实HSP90是蟾蜍他灵的主要作用靶标74。藤黄酸是很多中药的活性成分，作为抗癌药物目前正处于IIb期临床试验阶段，然而其作用靶标在很长时间内都没有得到确认75。最近，Yue等76,77应用化学蛋白质组学技术研究表明，波形蛋白(vimentin)可能是该单体药物发挥抗癌作用的主要靶标。
5．总结与展望
近年来，随着抗疟天然产物青蒿素的发现获得诺贝尔生理学或医学奖53，国内外兴起了有一波研究中药以及天然药物的热潮。虽然关于青蒿素是否是中药,以及两者之间的关系的争论一直没有一个明确的定论，但是并不妨碍医学科研人员对于天然产物的研究兴趣。然而，研究人员不得不面对的一个棘手的问题是，中药的多成分、多靶点以及复杂的体内代谢过程给药物靶标鉴定带来的挑战。蛋白质组学研究可以在分子层面揭示药物作用的物质基础，其中利用药物活性单体组分功能化的纳米亲和探针捕获与富集细胞内的靶标蛋白质，进而通过定性、定量质谱分析鉴定药物靶标蛋白质的化学蛋白质组学分析方法，在中药靶标蛋白质鉴定及分子作用机理研究中具有广阔的应用前景。
基于质谱的化学蛋白质组学药物靶标鉴定方法需要解决的关键技术之一，它是在尽量保持药物分子探针与靶标蛋白之间的亲和力不被破坏的同时，尽可能地减少药物分子与非靶标蛋白之间的非特异性吸附; 其次是在分离富集靶标蛋白以及洗脱、酶解靶标蛋白的过程中，尽可能减少目标蛋白的损失。我们相信，随着生物信息学、网络药理学、化学蛋白质组学等新兴学科和技术的交叉融合与不断完善，将会有更多、更新的药物靶标鉴定新方法、新技术出现，中药活性成分靶标蛋白质鉴定的报道也会越来越多，将持续推动中药现代化的研究向更高的层次迈进。
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