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今天要讲的是酶切，听到这个，估计有一多半的人会关掉这个窗口。 搞毛啊，酶切，不就是吧酶和Buffer和（huò）一和（huò），然后撇水浴锅里，然后取出来跑个电泳么？这有啥好讲的。 听上去是没啥好学的，但如果你觉得你行，就先回答下面几个问题，请听好： 1）内切酶和外切酶有啥差异？ 2）什么是限制性内切酶的星活性？ 3）什么情况下，要在酶切位点附近加上保护碱基？ 好吧，如果你能回答，也别急着关掉，拉到下面的赞赏，点100，然后顺手输个密码打个赏就行了。 如果你明显不知道，那么好的，我要开始装逼了。 首先来介绍一下酶切，次奥，酶切到底是用外切酶还是用的内切酶呢？ 答案很明显，用的是内切酶。因为内切酶中规中矩，会把双联的DNA像剪刀一样切断，而外切酶比较简单粗暴，产物不会是有那些粘性末端的片段，而是直接就把东西全都切烂的那种节奏，对了，就像下面这样： 清楚了这一点，那我们继续，限制性内切酶，为啥要叫限制性，因为这些内切酶都有特殊的酶切位点。限制性内切酶分为三大类，但由于I类和III类都是远端切开，然后切完再加修饰的，所以一般不会用在普通酶切上。常用的就是II类，也就是有回文识别序列的位点。 但光是II型的限制性内切酶也分成好多组，我按照大家常用和神级才用的内切酶，分了一个等级，大家感受一下： 至今，我在构建中最高只用到过地狱级这个水准。但根据你个人需要可以选择正确的酶的使用，即使是普通的酶切位点，经过你精巧的设计也能有DUANG一样的特效。比如，我可以用同尾酶设计一个简单的双酶切来改造载体，给你们演示一下，大概是下面这个节奏： 两刀下去再连接一下，就去掉了所有的酶切位点，是不是很酷？当然更复杂的还有填平技术和平末端连接，以及用那种高级酶切位点来进行载体的改造，这都需要你自己的设计。 接下去，问题来了，大家酶切的时候可能会遇到各种各样的问题。 最常见的就是下面这几个问题： 1）为毛切不断？ 2）为毛切不干净？ 3）为毛切错了？ 第一个问题其实很简单：你会不会用错酶了……好吧不开玩笑，首先要确定的是你进行酶切的底物是啥，如果是质粒的话，主要原因可能是因为质粒上的这个酶切位点有碱基被修饰了。甲基化等修饰都会导致无法切断的，这时候就别用DH5α了，换用JM109。还有比较常见的是用错Buffer，NEB的Buffer有四种，要确定双酶切的话用什么样的buffer才是最合适。 但如果是PCR产物去酶切呢，就要注意了，PCR产物由于片段比较短，所以需要加上保护碱基才能进行酶切。原理很简单，内切酶太胖了，短了站不上去。 第二个问题其实也不难，有几种可能性：第1，酶切后粘性末端退火了，又结合在一起了；第2，用错了Buffer，导致或者体系中该加BSA的没加，或者反应时间不够；第3，就是酶活性下降。这些其实都比较好解决，如果酶切后又退火，就直接高温终止反反应，就解链了。用错体系，及时纠正就OK了。活性下降的原因就是，你加酶的时候没放冰盒上，或者往了关冰箱，或者就是过期了……换掉就好…… 第三个问题稍微有点复杂，啥是星活性，说白了，就是内切酶该切的地方没切，不该切的地方瞎切的一种活性。多种因素可引发星型反应：比如，1）非最适的pH；2）Co2+、Mn2+取代Mg2+；3）酶浓度大于25u/ug；4）盐浓度降低；5）高浓度甘油的存在(>12%)；6）有机溶剂的存在等等等等……这种时候，降低酶的用量可以缓解星活性的产生。 好了，我装逼结束。酶切没有你想得辣么简单啦，但其实，你要是不做构建的话，学这些并没有什么卵用…… …华丽丽的分割线… 李莫愁博士：其实今天给大家讲的也只是酶切的皮毛，真正要用酶切来改造质粒，或者改造你的基因，才是上乘的酶切用法。有机会我们再来策吧……好啦，今天就到这里吧…… |
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