|
问：目前国内市场有哪些测序仪? 答：Illumina、BGIseq、Pacbio、Ion Torrent、Nanopore等等 问：这些机器的上机操作一样吗? 答：不一样。即使是同一个厂家的仪器，随着型号的不同，操作也有变化。例如，有的仪器芯片需要测序前加载，有的就可自动加载。 问：那这些测序仪的使用就没什么共通点吗? 答：有的。所有样本测序上机，别管是使用哪种测序仪器，都需要先进行建!库! 1、什么叫建库? 建库，即文库制备，是指将样本处理成可被测序仪读取的DNA片段，该片段需满足一定的长度，且在两端都连接了指定的序列（锚定序列、测序引物序列、标签序列等）。 目前市面上尚未有成熟的建库自动工作站，因此建库工作基本都靠实验室人员手工操作，建库结果取决于采用的实验方案、试剂种类、熟练程度等诸多因素影响。可以毫不夸张的说，建库工作量占了整个高通量测序实验中工作量的80%，其结果直接决定了测序下机数据的好坏。 原理上，市面上的建库试剂盒主要为三种建库方法：机器打断法，转座酶法，扩增法。 如何建库，这里不详述。大家感兴趣，可以参照咱们之前的讨论贴。或者也可以申请参加我单位每年针对疾控系统开展的建库及高通量测序实操培训班。 今儿咱们主要聊聊什么样的文库才叫好文库！ 好文库标准：连接上接头的文库浓度达标 及文库片段长度达标 常用检测方法如下：（1）Nanodrop；（2）Qubit；（3）凝胶电泳；（4）Angilent2100及类似产品。 2、测序文库质量检测“兵器谱” （1）Nanodrop 原理：紫外吸收法 检测目的：文库中DNA的量 缺点：准确度较低，容易受文库样本中残存RNA、蛋白、盐和其他杂质的影响。 优点：a)无需其他耗材，便宜！b）秒级检测，方便。c）用量低，1ul。 总结：适合作为文库样本的初检或不具有其他高灵敏度检测方法时的替代品。 (2) Qubit  原理：荧光染料法 检测目的：文库中DNA的量 缺点：需额外购买染料、标准品和配套的小管。小贵。 优点：准确。排除RNA等杂质的感染 总结：Nanodrop精准版。追求质量的选用。 （3）凝胶电泳 详情可参照前贴： 原理：这就不用说了吧。。。 检测目的：文库不同长度的分子片段的分布情况是否合适。如小片段过多，或文库长度过长皆会影响后续测序实验。 优点：便宜；方便 缺点：结果粗略。 （4）Angilent2100及其类似产品  原理：毛细管电泳 检测目的：文库不同长度的分子片段的分布情况是否合适。如小片段过多，或文库长度过长皆会影响后续测序实验。 优点：精准；结果可量化；可形成图表报告。 缺点：需购买配套的芯片和胶。小贵！ 总结：凝胶电泳的土豪版。追求质量的选用 总而言之， 文库质量很重要， 质量控制要做好！ 简单Nano+跑胶， 精准Qubit毛细管。
|
|
|
