|
编者按： 中国科学院上海生命科学研究院胡国宏研究员团队和山东大学齐鲁医院杨其峰教授团队合作，在乳腺癌器官特异性转移机制研究方面取得重要突破。相关研究成果以“Differential Effects on Lung and Bone Metastasis of Breast Cancer by Wnt Signalling Inhibitor DKK1”（WNT信号抑制分子DKK1在乳腺癌肺和骨转移中的不同作用）为题，于2017年9月11日在Nature Cell Biology上发表。上海生命科学研究院博士研究生壮雪倩为第一作者。本文对其进行了非常详细的解读，文章有点长，不知道有几位同学能仔细读完读完的可以在留言区举个手 背景 癌细胞转移是乳腺癌威胁病人生命的主要原因。乳腺癌转移多发于骨、肺、肝和脑，但转移同时具有器官特异性，即不同癌细胞对不同转移靶器官的倾向性不同。近年来的研究发现了一系列标记乳腺癌组织特异性转移的基因，但是晚期乳腺癌患者的多器官转移是系统性疾病，对于这些标记基因在多器官转移过程中的综合作用的研究却较少，阻碍了对晚期病人预后的全面预测及针对性治疗。 Wnt信号通路包括经典通路和经典通路，经典通路由β-catenin介导并激活TCF/LEF家族等转录因子，而非经典通路则不依赖β-catenin，WNT/Ca2+通路激活钙调磷酸酶、钙/钙调素依赖性蛋白激酶II（CaMKII）、蛋白激酶C，进而激活下游其他信号；WNT/PCP通路则激活Rho-ROCK和RAC1-JNK-JUN信号轴。 DKK1与LRP5/6结合来减弱细胞对WNT配体的敏感性来抑制Wnt信号传导。 文章思路 研究结果 1. DKK1 secretion is associated with breast cancer metastasis organotropism 作者首先通过质谱分析检测MDA231细胞系及其分支转移至肺或骨时不同蛋白表达情况，发现69种和59种蛋白分别与肺转移和骨转移相关（FIG 1a）. 在常见的8个蛋白（Table 1）中仅有DKK1在肺转移时明显下调而在骨转移时上调，其余7个则均为上调。 （热图中low和high分别代表肺和骨转移选择性的高低，横坐标为乳腺癌细胞系，纵坐标为发现的蛋白） 作者进而通过用具有不同靶器官选择性的乳腺癌细胞分别在蛋白水平和mRNA水平确认DKK1的表达具有器官特异性（FIG 1b,c）。 （不同细胞系裂解产物中DKK1蛋白水平无明显差异，培养基中DKK1差异则比较明显，可能是分泌型蛋白，主要在胞外起作用。mRNA水平则有明显的差异） 不同分子型乳腺癌患者的血清DKK1水平，其中三阴型乳腺癌（TN）患者的DKK1水平明显低于其余两型（FIG 1d）,这种类型容易在肺部复发；相应的，仅在肺部复发的乳腺癌患者血清DKK1水平比仅在骨骼复发或者无远处转移而复发的乳腺癌患者要低（FIG 1e）。 注：按分子分型，乳腺癌分为：luminal型、HER-2+型和Basal-like型,其中Basal-like型分子表达为ER（－）/PR（－）/HER-2（－），相当于三阴乳腺癌。 DKK1水平较低的乳腺癌患者更倾向于想肺部转移，同时也能防止向骨骼转移。乳腺癌肺转移的患者DKK1水平较低时其生存时间较高DKK1者要短，而在骨转移时相反（FIG 1f）。在患者血清中DKK家族其他成员要么未检测出来（DKK2和DKK4），要么与转移瘤无关（DKK3, Supplementary Fig 1a）。这些结果说明DKK1和乳腺癌转移器官特异性存在单一的联系。 2. DKK1 suppresses lung metastasis of breast cancer DKK1抑制乳腺癌肺转移 为了稳定表达或者沉默DKK1，作者选择了转移能力适中的的SCP28乳腺癌细胞，通过蛋白水平和mRNA水平检测过表达和沉默效果，并且在Hela细胞内用TOPFLASH luciferase activity检测DKK1过表达后对WNT通路的抑制情况（Supplementary Fig. 1b,c and Fig. 2a） DKK1过表达时明显减少肺转移，肺部结节减少，并且延长了小鼠生存时间（Fig. 2b-d）。
不管是早期肿瘤细胞种植（Supplementary Fig. 1d and Fig. 2e）还是晚期转移瘤的生长（Supplementary Fig. 1e and Fig. 2f），都能被DKK1过表达而抑制。（上排 1d：SCP28注射后7天检测肿瘤细胞种植情况；2e：不同时间点肺部GFP+肿瘤细胞计数，绿色的是肿瘤细胞。下排 1e：SCP28注射后4-9周肺转移瘤生长曲线；2f：肺转移瘤Ki67染色。注：Ki67是一种增殖细胞相关的核抗原，其功能与有丝分裂密切相关,在细胞增殖中是不可缺少 ,它标记的是处于增殖周期中的细胞，该标记阳性率越高，肿瘤生长越快）。
当DKK1被沉默时，增加了肺转移瘤的形成（Fig. 2g），缩短了小鼠的生存时间（Fig. 2h）。
作者将乳腺癌细胞换成4T1和MMTV-PyMT，分别在其内过表达DKK1，经尾静脉将4T1细胞注射至BALB/c小鼠（Fig. 2i,j）、将MMTV-PyMT注射入C57小鼠（Fig. 2k），获得了和前面一致的结果。
3. DKK1 suppresses macrophage and neutrophil recruitment in lung metastases 分析DKK1调节乳腺癌肺转移的机制之前，作者首先检测了肿瘤细胞的内在恶性，发现DKK1过表达或者沉默并不影响肿瘤细胞在体外生长、瘤体形成、凋亡、迁移以及经内皮细胞侵入性（Supplementary Fig. 1g-k）。（g:细胞生长曲线，h:瘤体形成，i:细胞凋亡，j:肿瘤细胞迁移距离，k:经肺源（ST1.6R）和骨源（HBMEC-60）内皮细胞的侵入能力）
其他人报道巨噬细胞、中性粒细胞、内皮细胞、纤维母细胞、间充质干细胞以及NK细胞等再肿瘤转移时起到重要作用，作者通过流式细胞学分析肺转移瘤内这些非肿瘤细胞（Supplementary Fig. 2a），发现DKK1过表达时抑制，而沉默时促进CD11b+F4/80+巨噬细胞和CD11b+Gr-1+髓细胞而不是其它细胞在肺转移瘤内募集（Fig. 3a and Supplementary Fig. 2b）。
并且利用免疫组化技术确认了DKK1过表达抑制巨噬细胞和中性粒细胞的募集（Fig. 3b,c）。
这些免疫细胞的的变化并不是由于其起源的改变，因其在小鼠的脾脏和骨髓的数量保持不变（Supplementary Fig. 2c）。
因Gr-1抗体能识别Ly6C和Ly6G抗原，所以按照CD11b+Gr-1+细胞识别Ly6C和Ly6G的不同进行分类。在肺转移瘤内大部分CD11b+细胞是Ly6G—Ly6C—（绿色方框78.8%）或者 Ly6G+Ly6Cm（红色方框14.1%）,而少量是Ly6G—Ly6Chi（蓝色方框2.3%）。此外，大多数CD11b+Gr-1+细胞呈Ly6G阳性（94.2%）（Supplementary Fig. 2d）。
在肺转移瘤内，当DKK1过表达时CD11b+ Ly6G+Ly6Cm细胞减少，沉默时增加（Fig. 3d），而CD11b+Ly6G—Ly6Chi无明显变化（Supplementary Fig. 2e）。
CD11b+ Ly6G+Ly6Cm细胞表达粒细胞标志基因Nos2和Prok2，但不表达单核细胞标志基因Arg1（Supplementary Fig. 2f）。与具有大圆形核的单核细胞特征的CD11b+Ly6G—Ly6Chi细胞相比，这些细胞具有特征性带状或分段的细胞核（Supplementary Fig. 2g）。这些数据表明DKK1调节的CD11b+Gr-1+髓细胞主要是Ly6G阳性的中性粒细胞。
作者进一步观察发现DKK1过表达时抑制了肿瘤诱导条件培养基招募THP-1单核细胞的能力，却并不影响其增殖（Fig. 3e and Supplementary Fig. 2h）；相反，当沉默DKK1时，促进条件培养基诱导的THP-1迁移（Fig. 3e and Supplementary Fig. 2i）。
DKK1对免疫细胞募集的调节作用同样适用于小鼠骨髓来源的原代巨噬细胞和CD11b+Gr-1+细胞（Fig. 3f,g and Supplementary Fig. 2j）
当SCP28与巨噬细胞进行共培养时，出现巨噬细胞浓度依赖性的促肿瘤细胞生长现象（Supplementary Fig. 2n）
这些数据与之前观察到的DKK1抑制肺转移瘤早期种植和肿瘤细胞生长的结果一致（Supplementary Fig. 1d,e and Fig. 2e,f，见前）。由此可见DKK1抑制（乳腺癌）肺转移是通过减少免疫细胞募集来实现的。 作者发现在免疫细胞募集时，肿瘤来源的DKK1是以自分泌形式起作用的，于是在用（肿瘤诱导）条件培养基处理肿瘤细胞之前，在培养基里先加入DKK1来模拟DKK1过表达，发现其这样能抑制条件培养诱导的THP-1细胞迁移（Fig. 4a）
作者通过以下4个实验结果发现DKK1抑制免疫细胞募集可能是通过抑制WNT非经典信号通路，而不是经典通路。①在SCP28内表达显性负突变体ΔC-LEF1或ΔN-TCF4（Supplementary Fig.3a-d）来抑制WNT经典信号通路并不能抑制肺转移，并且也不能挽救DKK1沉默促进免疫细胞募集的作用（Fig. 4b,c and Supplementary Fig. 3e-h）。尤其是ΔC-LEF1反而促进了肺转移，其可能原因是ΔC-LEF1间接抑制了作为经典WNT信号通路下游目标的DKK1的表达（Supplementary Fig.3a）。②过表达激活的β-catenin（ΔN-CTNNB1）不能解除DKK1过表达抑制肺转移的作用（Fig. 4b,d and Supplementary Fig. 3g）
SF 3a：左：DKK1沉默同时过表达ΔC-LEF1，DKK1的沉默不受影响，仅有ΔC-LEF1过表达时DKK1表达受到抑制；右上：DKK1沉默同时过表达ΔN-TCF4；右下：DKK1过表达同时过表达ΔN-CTNNB1。
F 4b:左 ΔN-TCF4不能抑制DKK1沉默后促肺转移作用；右 ΔN-CTNNB1不能解除DKK1过表达抑制肺转移的作用
SF 3e:DKK1未沉默时ΔC-LEF1促进肺转移，DKK1沉默后ΔC-LEF1过表达抑制WNT通路不能抑制肺转移； SF 3f: ΔC-LEF1不能抑制DKK1沉默后促THP-1迁移的作用
SF 3g,h中性粒细胞核巨噬细胞募集情况
SF 3i: WNT 5A作用与DKK1沉默时相似，p-JUN、p-p65、LTBP1、PTGS2表达增加；
SF 3j: WNT5A促进THP-1细胞迁移；
接下来作者要找出DKK1通过调节哪一条非经典WNT通路来调节乳腺癌转移，结果发现DKK1过表达时WNT/PCP通路下游的RAC1-JNK-JUN信号轴和WNT/Ca+通路下游的CaMKII—NF-κB信号轴有所下调（Fig. 4h and Supplementary Fig. 4a）
相应的，DKK1沉默时，这两条信号通路被激活（Supplementary Fig. 4b）
其他非经典WNT通路下游的Rho、PKC、ERK、AKT、p38和NFAT则不受DKK1调节（Supplementary Fig. 4c-e）
JUN过表达、RAC1抑制剂（EHop-016）和JNK抑制剂（SP600125）能调节THP-1迁移，而Ca2+信号或者其他WNT通路下游信号的抑制剂则无此作用（Fig. 4i-k）
SP600125直接作用于THP-1不能影响其迁移（Supplementary Fig. 4f）
由上述数据推断DKK1可能通过抑制WNT / PCP-JNK信号传导来调节免疫细胞募集中涉及的一些肿瘤分化因子，通过质谱分析在DKK1过表达的SCP28和对照组找到了10个蛋白（Supplementary Table 2），然后筛选和鉴定出跟免疫细胞迁移相关的一个蛋白——PTGS2（也就是环氧化酶2，COX2）（Supplementary Table 3）。
然后确认PTGS2表达能相应地被DKK1、WNT5A和JNK抑制剂调节，而CaMKII抑制剂则不能调节（Fig. 5a,b and Supplementary Figs. 3i,4a,g,h）
当用PTGS2抑制剂塞来昔布处理肿瘤细胞后，发现条件培养基诱导的THP-1迁移减少（Fig. 5d）
而在SCP28细胞内过表达PTGS2时，能够抵消DKK1和SP600125对THP-1迁移的抑制作用（Fig. 5e）；相应的，PTGS2沉默后能抑制DKK1沉默诱导的THP-1迁移（Fig. 5f）
在条件培养基中加入PGE2能促进巨噬细胞和中性粒细胞迁移，抵消DKK1和SP600125的作用（Fig. 5g,h and Supplementary Figs. 4i）
相应的PGE2的受体PTGER2和PTGER4在THP-1、巨噬细胞和原代CD11b+Gr-1+髓细胞大量表达，而肿瘤细胞和其他基质细胞则不表达（Supplementary Figs. 4j）。
综上数据可说明DKK1是通过抑制WNT/PCP-JNK信号和PTGS2表达来抑制免疫细胞募集的。 其他人的报道以及作者前面的质谱分析发现latent TGF-β结合蛋白1（LTBP1）在肺转移瘤里上调。LTBP1与TGF-β结合伴随其分泌，并增加其生物利用度，由于TGF-β信号在乳腺癌肺转移中起重要作用，所以作者猜测LTBP1在DKK1调节肺转移瘤时发挥了某些作用。
LTBP1沉默时会导致TGF-β1分泌减少（Fig. 6c）
DKK1能在蛋白水平减少TGF-β1的分泌，而对其mRNA无影响（Fig. 6d and Supplementary Fig.5c）
当加热（80℃，10min）SCP28条件培养基时可以激活静息的TGF-β，而DKK1则通过SMAD结合元件（SBE）活性下调、p-SMAD2减少、SCP28侵入性下降（Fig.6f）来抑制TGF-β对加热条件培养基的应答（Supplementary Fig.5d and Fig. 6e）。这些数据表明DKK1能抑制LTBP1的表达和降低TGF-β的生物利用度。
然后作者探索DKK1是通过什么通路来调节LTBP1的。他们发现用SP600125抑制RAC1-JNK通路对LTBP1影响并不大，而抑制CaMKII—NF-κB能彻底抑制LTBP1并且增强DKK1在SCP28、MCF10CA1a细胞内对LTBP1的调控。（Fig.6a and Supplementary Fig.5e-g）
F 6a（下排）：SP600125不能抑制LTBP1表达，而BAY（NF-κB抑制剂）可以抑制LTBP1表达并且增强DKK1的作用。
SF 5e:左：CaMKII抑制剂（KN-93）明显抑制p-p65表达，而和PKC抑制剂（Gö6850）无明显影响；中：SCP28细胞 KN-93抑制p-p65进一步抑制LTBP1，加强DKK1过表达作用；右：沉默DKK1可减少对NF-κB的抑制，但挽救KN-93对NF-κB的抑制作用不明显。
SF 5g：上：4T1.2细胞，结果与SCP28细胞（F 6a下排）一致；下：SCP28细胞 沉默DKK1使LTBP1表达增加，但不能解除BAY的作用。
另外作者用NF-κB应答报告基因和p65入核的情况来验证DKK1对NF-κB的调控（Fig.6g and Supplementary Fig.5i-j）
SF 5j：DKK1过表达时p65入核减少。
绿色部分是NF-κB在LTBP1启动子上的结合位点，PLTBP1是完整启动子，ΔPLTBP1切除了NF-κB在LTBP1启动子上的结合位点。
6. PTGS2 and LTBP1 mediate the effect of DKK1 in lung metastasis LTBP1沉默和塞来昔布能阻断DKK1沉默时的促肺转移作用（Fig.6i左），并且塞来昔布能减少肺转移瘤里Gr-1+和巨噬细胞的比例，而LTBP1沉默无此作用（Fig.6i中、右），这也与在体外发现的LTBP1不影响免疫细胞迁移一致（Supplementary Fig.6a）。
另外LTBP1沉默能逆转DKK1沉默时肺转移瘤内的促SMAD3磷酸化作用（Supplementary Fig.6b）。这些数据证实了PTGS2和LTBP1分别通过调节免疫细胞招募和TGF-β生物活性来调节肺转移。 作者发现PTGS2和LTBP1的表达与乳腺癌细胞肺转移能力正相关，而与骨转移无关（Supplementary Fig.6c）。
在乳腺癌患者血清中，DKK1和PGE2呈现负相关（Supplementary Fig.6d）
免疫组化分析也发现在肿瘤中DKK1和LTBP1、PTGS2呈负相关（Supplementary Fig.6e）
综上可知PTGS2 and LTBP1介导了DKK1在乳腺癌肺转移中的作用 DKK1在肿瘤转移器官选择中的不同作用 与DKK1抑制乳腺癌肺转移相反，以前的研究已经发现DKK1促进乳腺癌骨转移。作者通过向无胸腺小鼠心内注射SCP28细胞来模拟骨转移，发现DKK1过表达时骨转移和骨溶解增加（Supplementary Fig.7a），而DKK1沉默时减少了骨转移，小鼠瘫痪症状减轻（Supplementary Fig.7b）。这与DKK1在肺转移中的作用明显相反。
作者通过在NOD/SCID小鼠乳腺脂肪垫注射SCP28细胞来模拟原发肿瘤转移的情况。DKK1过表达时对原发肿瘤生长影响不明显（Supplementary Fig.7c）
在同一只小鼠身上，发现DKK1明显抑制肺转移，而骨转移明显增多（Fig. 7a,b）
向BALB/c小鼠注射4T1.2细胞同样发现DKK1过表达抑制肺转移和免疫细胞募集，但是加重骨转移（Fig. 7c-e），而对原发肿瘤的生长和肿瘤细胞的扩散影响不大（Supplementary Fig.7d，e）
SF 7d：22d后DKK1过表达时肿瘤体积增加不如对照组； SF 7e：小鼠血液中肿瘤细胞叽集落形成分析
并且能促进肿瘤细胞条件培养基诱导的原代骨髓细胞的破骨形成（Supplementary Fig.7f,g）
在骨髓细胞培养基里加入rDKK1或者WNT通路抑制剂（XAV939）促进破骨形成，而用WNT3A处理则作用相反（Fig.7f）
破骨细胞成熟是由成骨分泌的RANKL和OPG来调节的，实验发现在DKK1抑制而WNT3A促进成骨前体细胞内OPG的的表达和分泌（Fig.7g and Supplementary Fig.7h）
（F 7g：MC3T3细胞）
所以DKK1是通过调节骨转移瘤中成骨细胞的经典WNT信号通路来促进破骨形成的。 联合作用于JNK和TGF-β信号通路能阻止肺转移和骨转移 经典WNT通路抑制对转移瘤或许不是最佳选择。BALB/c小鼠注射4T1.2细胞后再用经典WNT通路抑制剂（XAV939）处理小鼠（Supplementary Fig.8a）对原发肿瘤生长、肿瘤细胞扩散和费注意的抑制作用并不明显（Fig.8a and Supplementary Fig.8b,c）
但是却明显加重了骨转移（骨溶解面积增加，破骨细胞数增加）（Fig.8b,c）
这些数据说明针对经典WNT通路的策略不能有效抑制肺转移，反而增加骨转移的风险。于是作者在用4T1.2细胞诱发原位肿瘤的小鼠身上，同时应用JNK抑制剂（SP600125）和TGF-βRⅠ抑制剂（SB431542）（Supplementary Fig.8d）
这些处理对原位肿瘤生长影响不大（Fig.8d）
但能明显减少肺转移（Fig.8e）
同时，抑制TGF-β以及联合处理能明显抑制溶骨性转移（Fig.8f）
这与已知的TGF-β在溶骨中的作用以及观察到的SB431542能抑制体外破骨形成而SP600125无此作用相一致（Supplementary Fig.8e）
因此联合治疗为转移瘤的治疗提供了一个合理的策略。
|
|
|
