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1993年的诺贝尔化学奖授予了两位科学家。一位是PCR之父、鼎鼎大名的Kary B. Mullis，另一位则是加拿大化学家Michael Smith。他的获奖理由是“对基于寡核苷酸的定点突变的建立做出了突出贡献”。 早期，人们尝试用辐射或化学诱变剂来实现突变，但并非位点特异的。70年代，Michael Smith与美国生物化学家Clyde Hutchison合作，利用突变的寡核苷酸引物和DNA聚合酶开发出一种更加通用的定点突变（site-directed mutagenesis）方法。之后，这种方法被不断改进，在质粒中引入单碱基变化以及插入和缺失。 如今，定点突变技术已成为研究蛋白质结构与功能之间复杂关系的有力工具，也是实验室中改造基因的常用手段。利用这种技术，我们能够研究蛋白质相互作用的位点，筛选有着理想性质的突变，引入或删除限制性酶切位点或标签。 基本原理 定点突变的基本过程需要合成一条短的DNA引物。这条引物包含所需突变，并与突变位点周围的模板DNA互补，这样它就能与目的基因杂交。突变可以是单碱基变化、多碱基变化、插入或缺失。单链引物由DNA聚合酶延伸，然后再由连接酶封闭缺口。之后转化大肠杆菌，产生突变的双链DNA分子。最后，通过DNA测序选择突变体，检查它们是否包含所需的突变。 最初，这种方法常面临突变效率低的问题，这主要是因为大肠杆菌存在甲基介导的碱基错配修复系统。针对这一问题，Thomas Kunkel进行了改进。他将待突变的DNA片段插入噬菌体，并转化到两种酶（dUTPase和uracil deglycosidase）缺陷的大肠杆菌中。这两种酶是DNA修复系统的一部分，防止dCTP自发脱氨形成dUTP。在突变的大肠杆菌菌株中复制噬菌体DNA，它的酶学机制就错误掺入dUTP来取代dTTP，产生包含尿嘧啶的单链DNA（ssUDNA）。随后这个ssUDNA被提取出来，作为突变的模板。所产生的异源双链DNA就由一条包含dUTP的亲本链和一条包含dTTP的突变链组成。之后，DNA被转化到携带野生型dut和ung基因的大肠杆菌菌株中。在那里，含有尿嘧啶的亲本DNA链被降解，只留下突变的DNA链。 新型工具 近年来，多家公司又对定点突变的方法进行了进一步的完善，推出了简单易用的试剂盒，如NEB、安捷伦、赛默飞世尔等。如今，你也有了更广泛的选择。 NEB Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit是NEB最新推出的产品。大家都知道，在大肠杆菌中繁殖的质粒DNA通常是甲基化的，而体外聚合而成的质粒则不会，利用这一差异，此试剂盒使用甲基化敏感的限制性内切酶DpnI来去除野生型质粒。 它利用Q5热启动超保真DNA聚合酶以及两条背对背的引物，在2小时内引入插入、缺失和替换。整个过程简单高效。首先，利用标准引物和Q5 DNA聚合酶进行指数扩增。然后，将扩增产物加入激酶-连接酶-DpnI酶的混合物中，在室温下孵育5分钟。这些酶实现了PCR产物的迅速环化和模板DNA的去除。最后，转化大肠杆菌细胞。
据NEB介绍，这种背对背的引物设计有诸多好处，不仅能转化不带切口的质粒，还能实现指数扩增，产生更多的扩增产物。性能强劲的Q5也为你带来信心。它的保真度比普通Taq酶高100倍，使得错误率极低，突变效率通常在85%-95%。NEB专家一般建议客户挑选三个克隆去测序就够了。至于质粒的大小，NEB试过14 kb，但客户试过20 kb。 就这种方法而言，插入片段的大小仅仅受限于引物合成的技术。一般而言，每条引物的5’端最多可附加50个核苷酸，这样就能插入100个核苷酸。不过，需要提醒一下，对于60nt以上的引物，建议使用HPLC或PAGE纯化。 对于引物设计，你也不必担心，NEB提供了一个在线的引物设计软件NEBaseChanger（NEBaseChanger.neb.com）。另外，NEB的网站也给出了一些指引。替换可设计在突变引物的中间，引物3’端至少要有10 nt与你的质粒互补。对于缺失，引物要设计在待缺失区域的两侧，方向相反。对于6 nt以上的插入，插入序列可分成两半，附在两条引物的5’端。
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来自： Irene_2017 > 《待分类》
