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自第一次发表使用重组病毒从另一种传染原递送抗原进行疫苗接种，至今已有25年了。乙型肝炎表面抗原（HBsAg）重组的牛痘病毒（VACV）被证明可以表达HBsAg，并且在黑猩猩中诱导出足以防止乙型肝炎感染的免疫。尽管早期有前途和进一步发展，但是许可人类使用的病毒载体疫苗列表很短，部分原因是通往人类执照的漫长而艰难的道路。关于这种疫苗的大规模生产和稳定性的问题通常需要大量的科学投资，并且要求其天然状态下是潜在人类病原体的病毒，必须满足严格的安全要求。对于那些仍然具有复制能力的病毒载体，就其性质而言，这些病毒载体在炎症期以外持续存在于宿主中尤其如此。实际上，在最简单的意义上，仍然有一系列的安全性随着减毒而增加，这必须认为减少的复制能力将导致免疫原性降低的看法相互权衡。然而，尽管存在这些挑战，但可以说驱动病毒载体疫苗持续发展的最重要因素是其有潜力的免疫原性，特别是某些属于世界上最严重的病原体和癌症的抗原（表1）。 在大多数情况下，复制性病毒感染在宿主中能有效地持续数年引发强大的免疫应答。这与作为亚单位DNA质粒或蛋白质递送的许多重组抗原相反；虽然这些被认为是相当安全的（取决于佐剂），但它们经常引发较差的反应原性。相反，在体内复制的、具有与野生型亲本相似活力的病毒疫苗载体通常是具有高度免疫原性的，但也具有重组、反应原性或逆转毒性的风险。寻找最佳培养基已经推动了减毒复制缺陷病毒载体的开发，这是旨在最大化免疫原性和安全性的策略（图1）。 反应原性：疫苗制剂在接种后诱导不良反应的能力。 在过去十年中，病毒疫苗领域的突破之一是认识到复制能力和病毒毒力并不总是与免疫学稳定相关。例如，VACV及其更安全、高度减毒（复制缺陷）表亲——改良的安卡拉痘苗病毒（MVA）和纽约减毒痘苗病毒（NYVAC）在动物研究中显示出堪比的、有时甚至更好的免疫原性。目前，广泛的病毒家族正在作为用于人类或兽医用途的疫苗载体得到深入开发，包括一些具有复制能力的病毒家族，还有许多是特异性减毒的病毒家族。表1概述了作为载体正在开发的主要病毒家族及其相关疾病。 表1 用于人类和兽医的病毒载体疫苗
YFV-17D，减毒黄热病病毒株17D 历史上，病毒的减毒是经验性的，通过在转化的细胞系或非典型宿主中连续传代，和通过非自然途径递送。许多病毒是复杂的病原体，大型DNA病毒如痘病毒，腺病毒（AdVs）和疱疹病毒将其大部分基因组整合至逃避免疫应答的宿主基因。许多这样的病毒基因编码影响特异性免疫防御的蛋白质，包括那些作用于早期先天途径的蛋白质，例如涉及干扰素的途径、模式识别受体（Toll样受体，TLRs），趋化因子和细胞因子，以及那些通过改变病毒肽的主要组织相容性复合物加工来作用于后续适应性反应的药物。迄今为止，大多数减毒过程，例如通过细胞系中的连续体外传代，对于丢失或变化的病毒基因的类型是非选择性的。最终，病毒变异株在小型动物中缺乏有害作用，使得它们不再致病，并且宿主很少或没有损害。然而，在非特异性减毒过程中丢失或改变的病毒基因在将病毒更好地用于具有更强效佐剂效应的重组插入的免疫呈递方面可能不是最佳的。鉴于许多病毒基因组现在已经得到很好的表征，未来为改善病毒载体的佐剂性质而进行设计以诱导不同类型反应的努力将基于靶向对宿主免疫系统有差异的特异性病毒基因。例如，敲除已经进化的减少宿主抗病毒免疫应答的病毒基因可以降低免疫逃避特性并改善某些病毒载体的佐剂特异性特征。然而，抗载体反应可能排除随后在个体中重新使用该载体的可能。 减毒痘病毒在天花根除运动中首次被使用，从而被进一步开发为疫苗载体。其中一种，MVA在鸡胚成纤维细胞中传代超过570次，损失了约15％的基因组，最终在哺乳动物细胞中复制缺陷。相反，NYVAC来自VACV的哥本哈根分离株，通过体外重组删除18个不同的ORF，导致复制缺陷。几项最新的研究表明，MVA维持强大的免疫刺激能力，甚至可能比NYVAC更强，而最近的HIV-1疫苗候选者的灵长类动物研究显示，这两种痘苗来源的载体诱导定性不同类型的免疫应答编码的Gag-Pol-Nef（组特异性抗原-聚合酶-HIV-1阴性因子）和包膜（env）抗原——NYVAC诱导CD4 T细胞显性反应，而MVA诱导更强的CD8 T细胞应答和伴随的CD4 T细胞应答。许多病毒蛋白（其中一些作用于TLR信号通路和其他抗原呈递细胞功能）的联合作用可能解释了这些差异。直到对体内结果有更好的预测分析，该过程很大程度上是经验性的，并且取决于最佳体内模型以评估每种载体的免疫刺激性质。然而，在经验减毒的MVA的情况下，基因的合理缺失可以进一步增强免疫原性，两个报告表明编码可溶性白细胞介素-1β（IL-1β）受体的B15R的缺失可以增加病毒特异性记忆CD8 T细胞反应。类似地，通过减少重组VACV的载体特异性基因表达，可以减少对载体本身的CD8 T细胞应答，从而相对于转基因而增强。未来的努力将继续沿着这些方向，旨在单独和组合地删除更多的基因，试图合理地增强这些病毒载体的免疫原性。 图1 一系列共刺激——从佐剂到活病毒 已经开发的减毒的复制缺陷病毒载体作为使免疫原性和安全性最大化的策略的一部分。它们处于一系列复杂性和复制潜力的中间，两种极端的疫苗技术已被许可用于人类使用。虽然临床疫苗开发需要长期的工作计划，但是这种定向疫苗的许可证（如果证明是安全有效的）仍然是完全可以实现和现实的目标。AAV，腺相关病毒；AdV，腺病毒；AS01，葛兰素史克公司的佐剂系统01；HPV，人乳头瘤病毒；MF59，诺华公司的水包油乳液佐剂；MVA，改良的安卡拉痘苗病毒；VEE，委内瑞拉马脑炎病毒；VLP，病毒样粒子。 初免-加强状况在20世纪90年代，DNA质粒疫苗的出现使人们兴奋。然而很快显而易见的是，DNA疫苗本身的免疫原性不足以产生防止人类困难疾病的T细胞应答。随着临床试验中使用的定量T细胞测定的进展，包括离体干扰素γ ELISPOT（酶联免疫吸附点）和培养的干扰素-γ ELISPOT测定以及多参数流式细胞术，与其他疫苗类型相比，病毒载体恢复了其增强的细胞免疫应答效力的中心阶段。然而，与DNA疫苗不同，在体内一次或两次施用后，宿主对病毒载体本身的结构蛋白的反应本身就成为自限型的，当载体用于多次免疫时，导致对疫苗插入物的反应降低。需要开发初免-加强方案以克服这些抗载体反应，同时使宿主对疫苗插入物的反应最大化。 最初，具有常见疫苗插入物的异源初免-加强方案通常使用DNA质粒来引发免疫系统。然而，最近兴趣点在于使用不同重组病毒载体的组合以及它们的施用顺序如何影响诱导的免疫应答的性质。现在已经在动物模型和人类中测试了多种方法，包括DNA-MVA、DNA-NYVAC、禽痘病毒（FPV）-MVA、流感-MVA、AdV-MVA、异源AdV-AdV和DNA-仙台病毒疟疾、艾滋病毒I型、结核病（TB）和丙型肝炎至癌症的许多疾病（表2）。在所有这些研究中，一致的观察是某些向量引发或增强反应的差异能力。DNA疫苗，FPV和流感病毒是良好的启动载体，而痘病毒（MVA和NYVAC）始终能够增强以其他方式引发的T细胞应答。现在大量数据表明，一般而言，重组AdV可以很好地引发和增强T细胞和B细胞的反应。最近，已经使用了表达相同疫苗插入片段的三种不相关载体模式的组合。已经通过更深入的分析来帮助这些载体的评估，特别是使用多参数流式细胞术，其允许不同T细胞群体的表型和细胞因子产生和效应子功能的解剖——由这种不同的载体和方式。将这些不同的免疫方案和载体策略引起的T细胞反应的“质量与数量”的保护性结果相关联仍然是该领域的挑战。 离体干扰素γ ELISPOT：ELISPOT（酶联免疫吸附斑点）法用于测定抗原特异性效应T细胞应答。典型的，脾细胞或外周血单核细胞与抗原孵育18 h，在此期间抗原特异性细胞释放细胞因子（特别是干扰素γ）被单克隆抗体捕获，可以使用改进的ELISA法计算出来。 培养的干扰素-γ ELISPOT：改进的离体干扰素γ ELISPOT法，包括一个在干扰素γ ELISPOT法之前持续很久的体内培养淋巴细胞的过程。典型的，在抗原及白介素-2存在的环境中培养10天。有证据表明不同类群的T细胞，主要是中枢记忆T细胞在培养过程中分化为效应T细胞，可以被此法检测到，类比离体干扰素γ ELISPOT法定量测定循环效应T细胞。 异源初免-加强：用不同疫苗重复免疫，用于单一疫苗无法诱导足够的保护性应答的情况，以增加更强的免疫应答。 增强体液免疫力。最近的工作已经建立了初免-加强免疫方案用于诱导B细胞以及T细胞应答，特别是AdV-MVA或异源AdV-AdV方案。与分枝杆菌相比，诱导适应性免疫反应的双臂可能有益于防止诸如疟疾寄生虫和许多病毒等病原体，细胞免疫可能是主要的保护机制。与MVA载体相反，AdV载体似乎能够引发和增强B细胞反应，与其引发，MVA载体能够更好地提高反应。这可能是AdV免疫后延长的高水平抗原表达的结果，与更适合于B细胞增强的MVA的短抗原相比，B细胞引发更有利。或者，关于浆细胞样树突状细胞的研究已经表明，一波细胞因子，特别是I型干扰素（IFN），然后是IL-6，对于将B细胞分化为响应于流感病毒感染的效应性浆细胞是必不可少的。相反，通过AdV载体启动转基因特异性抗体反应似乎与I型IFN产生负相关，这也与转基因表达的降低有关。在MVA的情况下，E3L赋予对I型IFN的抗性，并且对于鸡胚成纤维细胞的持续生长是必需的，并且E3L敲除病毒在细胞培养物中诱导增强的I型IFN和II-6鸡的水平。如果通过MVA的B细胞引发以与流感病毒诱导的类似的方式发生，则E3L介导的免疫逃避机制可以解释用该载体观察到的弱B细胞引发。最终，更好地了解细胞因子如何影响不同病毒家族对B细胞反应的诱导，这对于改善载体的合理设计和引发最佳抗体应答的初免-加强策略至关重要。 表2 供人类使用的病毒载体疫苗与初免-加强免疫机制的临床开发
85a，分枝杆菌Mycolyl转移酶85A抗原；AdCh63，黑猩猩腺病毒血清型63；ALVAC，减毒的金丝雀痘病毒；AMA1，顶膜抗原1；BCG，牛分枝杆菌卡介苗；CEA，癌胚抗原；CSP，环子孢子蛋白；del，删除；Env，包膜蛋白；FPV，禽痘病毒；Gag，组特异性抗原；gp160，糖蛋白160；HAdV-5，人腺病毒血清型5；ICAM1，细胞间粘附分子1；IL-2，白介素-2；LFA3淋巴细胞功能相关抗原3；M1，基质1抗原；MART1，被T细胞识别的黑素瘤抗原1；ME-TRAP，与多表位串融合的血小板反应素相关粘附蛋白；MSP1，裂殖子表面蛋白1；MUC1，粘蛋白1；MVA，修饰的痘苗病毒安卡拉株；Nef，HIV-1阴性因子；NIAID（NIH），国家过敏和传染病研究所（美国国立卫生研究院）；NMRC，美国海军医学研究中心NP，核蛋白抗原；NS，非结构蛋白;纽约NYVAC，纽约减毒痘苗病毒；preM，膜前蛋白；（r）BCG，重组BCG；TCR，T细胞受体；TRICOM，共刺激分子三聚体；UCLA，加利福尼亚大学，洛杉矶（美国）；VACV，痘苗病毒；VRC，Dale和Betty Bumpers疫苗研究中心；WNV，西尼罗病毒；YFV-17D，减毒黄热病毒株17D 循环预先存在的免疫力。通常感染人类的病毒存在预先存在的免疫力的问题。对于某些病毒载体，例如基于人AdV和疱疹病毒的病毒载体，这可能是一个主要障碍。例如，最近在II型试验中评估了基于人AdV血清型5（HAdV-5）载体的候选HIV-1疫苗，在HIV-1感染高风险的个体中进行，试验由于缺乏疗效而停止，但是在入组时，在先前存在的较高滴度的HAdV-5-中和抗体的个体中观察到获得增加HIV-1感染几率的非显着趋势。这个问题引发了关于使用这种普遍存在的人类病毒作为疫苗载体的激烈辩论，但是尽管HAdV-5载体平台存在这种挫折，研究者仍在积极地采取其他策略来提供可以克服预先存在的载体免疫的可行替代方案。这些方案包括修饰载体以表达异源腺病毒六邻体或使用罕见血清型的人腺病毒或来自其他物种如黑猩猩的腺病毒。重要的是，所有这些新的载体，特别是那些外来物种的新载体，都需要突破监管、安全和制造的障碍。 载体化疫苗的经验与理性设计。随着我们对免疫学和病毒生物学知识的不断扩大，已经建立了新的疫苗科学时代，为病毒载体疫苗的合理开发提供了基础。优化亚单位疫苗抗原设计和理解载体趋势，包括目标抗原加工和体内呈递，是至关重要。在VACV的案例下，已经显示给药途径71以及用于驱动转基因表达的痘病毒启动子可以影响抗原直接或交叉呈递给T细胞的程度。类似地，新的数据表明，由于抗原呈递细胞中的顿挫感染而在感染后期通常被阻止进入直接呈递途径的正痘病毒结构抗原也被特异性地隐藏在病毒工厂中，从而逃避交叉表达途径并阻碍痘病毒特异性CD8 T细胞反应的诱导。痘病毒早期或晚期启动子驱动的外来抗原不是这种情况，因为这些抗原通常不针对这种痘病毒工厂。更好地理解这一系列观察对疫苗诱导的针对载体和转基因的T细胞应答很重要，且这些数据可能解释为什么痘病毒载体如MVA使用相同载体进行免疫接种12个月后重新增强免疫在人体内是有效的。 “工程”免疫。与持续性DNA病毒如腺病毒相关的抗载体免疫的强大复杂性相反，缺乏其大部分结构抗原的工程化慢病毒已被开发用于在体内将基因递送到特定细胞以进行细胞内免疫的载体。某种程度上是由于慢病毒载体基因的最低表达实现的，部分原因是重复的体内给药（如在传统免疫中）不是目的。事实上，慢病毒目前正在被用来为癌症和HIV-1设计免疫力。含有T细胞受体基因的慢病毒的造血干细胞的转导现已进入癌症免疫治疗的临床检测。使用这些载体用针对HIV-1的中和单克隆抗体的编码的B细胞受体基因转导人CD34 细胞也已经有了大量临床前进展。还开发了将慢病毒载体靶向特定细胞类型（如皮肤树突状细胞（DC））亚类的策略。例如，已经开发了保留结合DC-SIGN（树突状细胞特异性ICAM3-抓住非整联蛋白）蛋白质功能的辛德比斯病毒融合蛋白的突变株。进一步的特异性靶向技术的发展可以大大增强病毒载体疫苗的合理设计、定点诱导和有效的免疫应答以预防广泛的传染病和癌症。 病毒载体疫苗最成功的应用无疑在兽医领域。与开发用于人类的疫苗相反，这需要更严格的监管要求，在人类志愿者中逐步进行临床试验，并获得更长的许可证和投资回报。目前，至少有12种病毒载体疫苗被许可用于兽医用途（表3），还有更多的病毒载体疫苗正在开发中。尽管如此，这些技术仍然面临着经典灭活疫苗竞争的艰难斗争，这些疫苗往往更容易生产。控制家禽禽流感的挑战是由经济学驱动，需要大量疫苗接种策略，如饮用水管理、气溶胶喷雾或卵内免疫接种（图2）。在维持疫苗效力的同时保持给药成本低，为重组病毒载体技术带来了相当大的挑战。一种成功的方法是使用新重组新城疫病毒（NDV），其通过卵内免疫方法一次性提供了控制两种不同禽类病原体的二价方法。正在使用复制缺陷型HAdV-5研究另一种重要和高度传染性的兽医病原体口蹄疫病毒（FMDV）的新疫苗策略。用表达FMDV衣壳和蛋白酶抗原的重组HAdV-5进行单次免疫后7天，在牛和猪中引发了保护性免疫。与灭活的全病毒疫苗不同，使用该载体疫苗平台区分感染和接种动物（DIVA；参见注释框 1）的能力加上大大增加的生物安全性，使这种有效的技术对于无FMDV的国家非常有利。类似地，对于家畜的重要呼吸道病原体，诸如牛结核病，正在探索重组HAdV-5或MVA疫苗载体。表达了分枝杆菌肌醇转移酶85A抗原的这些载体都被描述为牛分枝杆菌卡介苗（BCG）疫苗的有效增效剂。现在需要进行挑战性实验，以便在直接暴露之后以及在自然传播环境中评估这些BCG初免载体增强方案在免疫牛群中的保护作用。如果单独使用BCG疫苗更有效，使用载体疫苗来加强BCG引发的反应可能有助于控制牛结核病，牛结核病每年预计耗费世界各国的成本约为30亿美元。重要的是，牛结核病继续为候选人类结核病疫苗的设计和测试提供有用的免疫学观点。 表3 授权商用的病毒载体兽医疫苗
ALVAC，减毒的金丝雀痘病毒；Env，包膜蛋白；Gag，组特异性抗原；F，融合抗原；H5 HA，来自流感病毒H5的HA；HA，血凝素；HN，血凝素-神经氨酸酶蛋白；HVT，土耳其疱疹病毒；IBDV，感染性法氏囊病病毒；Pol，聚合酶；preM，膜前蛋白；VP2，病毒蛋白2；YFV-17D，减毒黄热病毒株17D。 病毒载体疫苗最初被开发用于诱导针对细胞内病原体的保护性T细胞应答。然而，到目前为止，病毒载体疫苗和直接作用于T细胞介导的免疫（可能除了BCG之外）的疫苗都已被许可用于人类使用。这种情况更加复杂，因为这些新方法已被选为用于常规疫苗方法未能有效的一些最复杂的人类病原体，包括恶性疟原虫疟疾、结核分枝杆菌和HIV-1。然而，重组病毒疫苗技术已经取得了实质性的进展。目前正在开发用于人类的载体列表如表2所示。目前，在人类临床试验中首次报道了令人印象深刻的T细胞免疫原性水平——这一目标尽管作出了广泛的努力，但尚未实现单独的DNA质粒疫苗技术。这一进步的关键是AdV载体疫苗的发展——AdV具有引发针对转基因的免疫应答的显着能力，可以通过用于相同抗原重组的第二载体（通常为MVA或第二载体）而被提升至高水平AdV的异源血清型。类似地，MVA和AdV都可以显着地增强由其他方式引发的免疫应答，例如BCG疫苗接种。在表4中提供了这两种广泛使用的载体的比较。 疟疾疫苗。使用表达前红细胞阶段疟疾抗原环子孢子蛋白（CSP）或血液阶段疟疾抗原顶端膜抗原1（AMA1）的两种HAdV-5载体的混合物最近取得了进展。在人类志愿者进行单次免疫后，通过离体IFN-γ ELISPOT测量每百万外周血单核细胞（PBMC）对500-1,000个斑点形成单位（SFU）的每种抗原的显着平均响应。消耗研究将响应定义为混合的CD8 和CD4 T细胞应答，其中CD8 表型是通过流式细胞术测量的IFN-γ分泌的应答细胞中CD4 表型的频率的3至5倍（M.Cesegah和T. richie，私人交流）。为了规避HAdV-5预先存在的宿主反应的问题，罕见的人类血清型或非人类灵长类动物的重组腺病毒也正在疟疾疫苗候选者中开发。正在临床前研究异源性AdV（如HAdV-35和HAdV-11）的引发和增强，并且令人鼓舞的是，表达与红细胞前期抗原血小板反应蛋白相关的粘附蛋白融合的重组黑猩猩腺病毒血清型63（AdCh63）多位抗原决定簇（Me-TrAP）随后用MVA引起的刺激引起人类志愿者抗疟疾抗原的平均水平>百万PBU /百万PBU（A.Hill，私人交流）。进一步的临床前研究还报道了在小鼠中使用AdV-MVA方案以诱导高滴度抗体应答和有效的T细胞应答。使用重组血液疟疾抗原裂殖子表面蛋白1（MSP1）的载体的具体HAdV-5-MVA方案诱导针对血液期感染的保护性抗体应答以及部分有效抵抗前期肝脏阶段感染。 异源痘病毒和DNA痘病毒免疫方案建立了人类初免-加强方法的价值，在临床试验中实现了比单载体方法更强的T细胞反应。尽管如此，疗效有限，因此，预计在2009-2010年这些新的AdV载体疫苗的IIa期疟疾挑战性研究将是重要的。即使成功，这些潜在的疫苗候选人将面临更多的挑战，包括人类（特别是非洲）人群中HAdV-5载体的高级预先存在的免疫力的潜在问题。此外，AdV载体在未成年非洲儿童的目标群体中的免疫原性仍有待观察。在发达国家，与自然免疫的非洲成年人和无疟疾志愿者相比，在1至6岁的儿童中，生活在高疟疾传播地区的疫苗免疫原性降低。 前红细胞阶段疟疾：疟原虫孢子体侵袭肝细胞并发展6-7天。这一阶段被认知为肝或前红细胞阶段并发展至血液阶段感染。肝阶段在临床上没有症状，感染者没有感染征兆或症状。 血液阶段疟疾：在肝阶段寄生虫在肝细胞中成长为裂殖子，在6-7天后破裂而出进入血液中，在红细胞中经历一个无性生殖的周期，持续约48 h。 斑点形成单位（SFU）：ELISPOT法相当于改进的ELISA法。在该方法发展阶段中，在平板膜上形成的“斑点”加以利用。结果表示为每百万细胞的SFU。 图2 人类和兽医疫苗可能的免疫途径 显示了各种可能的接种途径的潜在优势（ ）和缺点（-）。肌内免疫是人类免疫接种的主要方法，除了常规事先给药的牛分枝杆菌卡介苗（BCG）疫苗之外，还有一些例外。目前正在开展无针刺皮下装置的研发工作，例如涂上疫苗的贴片，可在没有受过训练的个体的情况下自行应用——大规模和紧急疫苗接种的明显优势。某些癌症疫苗也可以静脉内施用，但是一般来说，对于该途径来说，安全性问题仍然很高。通过使用口服或雾化疫苗可以增加胃肠道（GI）和呼吸道内的黏膜免疫力。这可以增强对病原体的保护性免疫，例如抗肺结核感染或粘膜组织中的HIV感染。鉴于已经报道在酸性条件下刺激免疫应答，重组腺病毒人血清型41（HAdV-41）是天然肠道病原体，可能被证明是口服途径更合适的载体。然而，在这些疫苗接种途径可广泛应用于人类之前，展示和维持疫苗安全性、功效、稳定性和剂量方面仍有许多工作要做。在保持疫苗功效的同时保持在人体中使用任何这些较不标准给药途径的成本，更重要的是，安全性对重组病毒载体技术构成相当大的挑战，而且还需要进行大量的概念验证研究。b兽医疫苗也可以使用标准的肠胃外免疫途径（皮内和肌内），但是使用替代途径如饮用水，喷雾剂或通过卵内免疫接种也是由经济学驱动的，动物安全性要求较低及需要大规模疫苗接种策略。 结核疫苗。类似于疟疾的情况，正在为人类结核病开展高度有前途的药物疫苗计划。在没有人类实验性挑战模式的情况下，这些仍然受到一些阻碍，尽管正在努力开发牛分枝杆菌BCG作为人类结核分枝杆菌的替代挑战。因此，一旦选择了候选疫苗，效能领域的试验仍然是必不可少的——一个既漫长又昂贵的过程。目前，在南非进行了一项BCG质粒和MVA-85A（含有编码分枝杆菌肌醇转移酶85A抗原基因的MVA载体）增强方案，目前正在进行IIb阶段的功效研究，迄今为止，在非洲已经证明了高水平的T细胞免疫原性，以及超过五百人的安全纪录，包括成年人、青少年、婴儿、艾滋病毒阳性个体以及肺结核感染者。结核病疫苗领域还正在开发AdV载体候选疫苗，并使用类似的方法通过使用罕见的人类血清型如HAdV-35来规避人类抗HAdV-5反应。表达三种TB抗原（85A，85B和10.4）（参考文献98）的融合蛋白的HAdV-35疫苗候选物可以增强由非人类灵长类动物中的BCG或重组BCG引发的T细胞应答，建立一种在人类中测试方法。已经在美国和南非137期的I期研究中报道了混合的CD8 和CD4 T细胞应答，但CD8 T细胞对人类对结核病免疫反应的贡献仍不清楚。对于两种主要的病毒载体疫苗候选物，临床前研究现正在积极寻求气雾化而不是全身给药的可能性，使用喷雾器来尝试增强可能对结核分枝杆菌感染更有保护作用的粘膜免疫（图2）。如果我们要解决这些突出的免疫学问题，那么来自非人类灵长类动物的进一步的临床前数据是必要的。 注释框1 受感染的免疫接种动物的分化 在某些家畜感染的情况下，有效的常规疫苗是可用的，但只能在基于血清学测试的疾病监测的情况下使用。天然感染和疫苗接种都会导致血清阳性动物。一个典型例子是牛口蹄疫病毒（FMDV）：虽然灭活疫苗可以有效地用于控制疾病，但它们不常用于“无FMDV”国家，因为这将危及一个国家的无疾病状态而导致国际贸易的巨大经济影响。FMDV疫苗已被用于在爆发期间减少疾病的传播，尽管疫苗接种的动物必须随后被屠宰，以重新建立该国的无FMDV状态。其他实例包括牛疱疹病毒1型感染（导致感染性牛鼻气管炎）、古典猪瘟和猪Aujeszky病（由伪狂犬病毒或疱疹病毒1引起）。防止这种情况的一个替代方案是开发允许感染疫苗接种动物（DIVA）分化的疫苗。这通过使用亚单位疫苗（例如，表达来自病原体的单一抗原的病毒载体）或从常规减毒疫苗中选择性缺失已鉴定的基因来实现。因此，疫苗接种和自然感染可以使用合适的诊断测定法进行区分，该诊断测定法鉴定针对疫苗中抗原的抗体对抗疫苗中针对抗原的抗体，该抗原缺失或不存在于疫苗中，接种动物仅暴露于野生自然感染型病原体。 黄病毒。黄热病是一种病毒性疾病，由于其流行病学的转变，在人类孩童中中重新出现。70多年来，人类已经使用了一种高效减毒疫苗（YFV-17D）。随着基于YFV-17D的减毒黄病毒活载体的发展，黄病毒疫苗合理开发的方案已经发展到编码黄病毒前膜和包膜蛋白的preM-Env基因已被西尼罗河病毒、日本脑炎病毒或登革热病毒产生嵌合载体。在这些载体中非黄病毒的抗原已经难以稳定地表达，但是已经报道了非黄病毒表位的插入，GFP104的稳定插入也是如此。在I-III期试验中进行了广泛和成功的安全和免疫原性测试后，日本脑炎的嵌合黄病毒可能是第一个被许可用于人类的病毒载体疫苗。 流感病毒。交叉流感疫苗的发展将是一个主流而长期探究的过程，特别是考虑到新型流感病毒，如甲型H1N1流感病毒流行株和季节性爆发高致病性禽流感。诱导针对保守的内部流感抗原的保护性T细胞应答而不是针对表面血凝素和神经氨酸酶抗原的变体特异性抗体应答是可能有机会成功的一种方法。目前正在进行使用表达高度保守的内核蛋白和基质1（NP-M1）甲型流感病毒抗原的MVA载体候选交叉流感疫苗的I期试验。该载体可以促进可能由于天然暴露引发的个体T细胞反应（S.Girbert，私人交流）。如果这些T细胞应答与保护有关，正如一些证据表明的，那么病毒载体疫苗方法与用于诱导针对变体特异性表面外壳抗原的抗体的季节性流感疫苗相比，可能证明是极为划算的。 HIV。疫苗发展面临的挑战也许比流行性感冒病毒的季节变异性和抗原性漂移更严峻的是艾滋病毒流行学的不断变化。用于HIV-1的T细胞诱导疫苗旨在减少病毒载量和CD4 T细胞损失、延长存活并减少传播。使用减毒的金丝雀痘病毒（AlVAC）、MVA或NYVAC重新开展痘苗病毒方案。已经开发并评估了每一种痘病毒疫苗载体中在人体中诱导HIV-1特异性免疫应答的能力。最近的HIV-1III期临床试验在一个大型社区的人群中使用AlVAC和AIDSVAX（单体HIV-1糖蛋白120）的组合，其传播风险是基于异性恋生活的。尽管研究发现预防HIV-1感染（31.2％疗效）的令人鼓舞的趋势，但后感染病毒载量或CD4 T细胞计数没有表现出可喜趋势。在非人类灵长类动物的临床前功效研究中，已经报道了当异源初免-加强组合中使用某些痘基载体来增强DNA引导反应时病毒载量的控制和CD4 T细胞计数的保存。它们能够诱导针对Env的抗体应答并引发不同程度的T细胞应答。在人类中，T细胞反应是混合的CD4 和CD8 表型，在细胞因子产生方面具有广泛功能。尽管如此，仍然认为这些疫苗方案需要改进以增加针对抗原如Gag和Pol的CD8 和CD4 T细胞应答的强度和广度，并诱导针对天然三聚体的高度中和抗体或高亲合力抗体Env蛋白。 HIV-1疫苗接种的HAdV-5重组体的开发迄今为止产生了最具免疫原性的候选疫苗，这被引入了一项名为STEP的人体功效试验。HAdV-5重组体仍然是HIV-1疫苗开发的领先方法，直到STEP试验以无效为由终止。尽管在人类疟疾和结核病初免-加强疫苗项目中引发了更强大的T细胞应答，但有一些人认为STEP试验的失败是为了解除旨在诱导T细胞介导免疫的疫苗概念的理由。然而，令人鼓舞的是，在初步的失败之后，讨论重新集中在进一步优化疫苗免疫原和技术上。的确，现在报道了非艾滋病毒感染的高T细胞诱导需要在艾滋病毒疫苗领域相匹配。HIV-1疫苗开发已经开始关注其他较不成熟的嵌合病毒载体技术。目前，仙台病毒、巨细胞病毒（CMV）、呼肠孤病毒、单纯疱疹病毒和NDV正在由包括国际艾滋病疫苗行动组织（IAVI）在内的一系列群体进行评估。最近使用CMV作为载体已经表明，该载体在严格的SIVMAC（猕猴的猴免疫缺陷病毒）恒河猴猕猴挑战模型中具有显着的功效，超过了另一项使用HAdV-5的研究观察到的病毒载量的抑制。替代策略可能会结合目前可获得的最具免疫原性的初免-加强方案，如AdV-MVA或异源AdV-AdV方案甚至三重组合，以促进T细胞和B细胞应答的聚集。最近已经描述的重组HAdV-26-HAdV-5方案，可以诱导针对恒河猴中的SIVMAC Gag的T细胞应答，比由同源HAdV-5方案诱导的应答更强，更多功能性和保护性。事实上，在这些猕猴中，平均每百万PBMC的平均值> 2,000 SFU，而在STEP试验中同源HAdV-5初免-加强方案下志愿者每百万PBMC的平均值约为300 SFU。未来的研究将揭示这些方法是否可以持续改进在SIVMAC恒河猴猕猴挑战模型中由DNA和HAdV-5疫苗组合设计的免疫和病毒控制基准。 表4 人腺病毒和修饰的痘苗病毒安卡拉病毒载体的比较
描述了病毒粒子，基因组，载体向性，载体生成和转基因插入物设计的关键差异。CEFs，鸡胚成纤维细胞；CEV，细胞相关包膜病毒；EEV，细胞外包膜病毒；HAdV-5，人腺病毒血清型5；IEV，细胞内包膜病毒；IMV，细胞内成熟病毒；纽约NYVAC，纽约减毒痘苗病毒；VA，病毒相关。 癌症疫苗。癌症疫苗领域不仅面临诱导强大、持久、有效的免疫应答（许多传染病疫苗共享问题）的问题，而且还面临着如何打破对自身抗原的耐受性——根据定义，在免疫缺陷环境中，抗原的弱免疫原性或功能性非免疫原性这一独特和复杂的挑战。有趣的是，某些癌症疫苗在具体情况下似乎有曙光。使用治疗性病毒载体疫苗靶向癌胚抗原（CEA），在与局部放射，化学疗法或细胞毒性T淋巴细胞蛋白4（CTLA4）的组合特异性单克隆抗体，已经使一些患者存活率有所改善。在该设置中，一个“抗原级联”已经观察到，由此给CEA的T细胞应答不仅接种后并且对其它肿瘤相关抗原（TAA）重新应答中有所显现，这可能更有效的诱导免疫靶向癌细胞。表达TAA的MVA载体也正在进行高级临床试验，作为对肾、前列腺和非小细胞肺癌的一线疗法的补充。最近的免疫学分析表明，激活的自然杀伤细胞基线水平与接受化疗的肺癌患者随后在MVA-MuC1-II-2的疗效有显着的相关性。激活的自然杀伤细胞的水平潜在地可以用作可能受益于病毒载体免疫联合治疗的患者的预测生物标志物。与免疫损害的病毒感染一样，在治疗环境中使用癌症疫苗将重新建立功能强大的免疫应答，其可在潜在的耐受性环境中维持——作为一部分免疫逃避策略诱导的癌症治疗。在这一点上，联合治疗在癌症疫苗领域具有最大的希望，尽管来自小鼠和非人类灵长类的临床前研究数据表明，表达候选TAA的AdV载体可以破坏耐受性。还有待观察基于AdV载体的候选癌症疫苗是否可以在人类试验中实现比基于痘病毒的免疫疗法更好的免疫原性。 癌胚抗原（CEA）：一种癌胚膜糖蛋白，属于免疫红蛋白基因超家族。CEA在幼儿胃肠组织中表达，也在很多结肠、直肠、胸腺、肺、胰腺癌细胞中过度表达。CEA可以作为恶性肿瘤和肿瘤相关性抗原的血清学标志物，广泛用作癌症疫苗的靶向物。 大多数病毒已经发展出逃避宿主免疫应答和以不同方式调节后续炎症环境的机制。这些逃避属性与理想疫苗佐剂的免疫刺激性质相反。然而，在新的基因组学时代，编码具有免疫逃避特性的因子的特定病毒基因正在被靶向以增强这些免疫刺激性质。疫苗载体探索过程中，这种新科技不仅使用已建立是病毒载体进行疫苗接种，而且还在探索并表征新的病毒。例如，正在进行研究使用多种策略来寻找替代载体来规避先前存在的载体免疫的问题。这些载体与新的疫苗初免-增强方案相结合，将引发更强大、更广泛和更持久的效应应答，为免疫学问题提供了有希望的解决方案。许多新载体系统的出现不能分散改进当前载体的机会。敲除病毒基因以改善抗原呈递，改善佐剂效应和定向免疫应答是重要的新研究路线。新技术包括通过在细菌“重组”染色体以更容易地操纵痘病毒基因组，以及将高通量转基因插入AdV载体，包括在转基因启动子中使用细菌tet操纵子元件来关闭转基因的转录，可能对病毒生长有毒或有害。这种技术的使用将被用于一系列不同的载体平台，因此允许筛选新的安全的病毒疫苗载体，但是对于它们递送的重组疫苗抗原显示出改善的免疫原性。 用于动物和人类的病毒载体疫苗的发展面临着科学和管理领域的巨大挑战。然而，这些技术终于实现了动物的功效，并且在人类中长期探究，特别是疟疾、结核病和流行性感冒领域的强大免疫应答。这些新技术的翻译将有助于疫苗开发，以应对该领域中一些最棘手的挑战，如癌症和HIV-1。复制缺陷病毒载体疫苗的是许可的，因为它们位于两种极端之间——蛋白质-佐剂疫苗和活病毒疫苗，两者都经过相当大的努力以获得许可。随着第一种针对日本脑炎病毒的嵌合黄病毒疫苗等待监管批准，该项研究为许多其他病毒载体疫苗的高级临床开发铺路。接下来的25年将成为疫苗科学复兴的充满挑战但令人兴奋的纪元。 参考文献： Draper SJ, Heeney JL.Viruses as vaccine vectors for infectious diseases and cancer. Nat Rev Microbiol. 2010 Jan;8(1):62-73. |
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