代谢组学问答四十八式，准备好接招了吗？（二）

样品准备第十 一式代谢组学可以检测哪些样品？

代谢组学主要研究的是作为各种代谢路径的底物和产物的小分子代谢物（MW<>

其样品主要是尿液，血浆或血清，唾液，以及细胞和组织的提取液。

第十 二式样品需要准备多少量？

细胞：1*10⁷

以动物细胞两种形态为例                                                                               

1.悬浮培养的细胞：

• 连同培养基转移到15 mL的离心管（进口）中

• 低速离心，使细胞沉淀于离心管的底部（1*10⁷个细胞为宜）

• 倒掉培养基（尽量倒干净）后（可以用PBS快速清洗一次，再次离心，倒掉PBS（尽量倒干净），将离心管的尖端插入液氮中，淬灭细胞

•  -80度冻存，干冰邮寄，每个样品最好准备两管。

2.贴壁培养的细胞：

• 快速倒掉培养基

• 倒入PBS（若用移液枪加，则靠着培养皿壁加入，以免将细胞冲起），清洗一次，

• 倒掉PBS，用移液器吸尽残余的PBS，将培养皿底部（外壁）接触液氮10 s，淬灭细胞

• 加入500微升预冷的甲醇-水（4：1，V/V）（需色谱纯的甲醇以及双蒸馏水），

• 用细胞刮刀将细胞刮下，移液枪转移至1.5 mL的离心管中

• 向培养皿中加入500微升预冷的甲醇-水（4：1，V/V）

• 将剩余的细胞尽量全部转移至1.5 mL的离心管中

• -80度冻存，干冰邮寄。

血清：200ul

1. 用离心管收集血液，37℃（或室温）静置 30min或1h 进行凝固分层；

2. 3000rpm 4℃或常温 离心10min，待血细胞完全沉降都管底后，取上清转至干净的离心管中；

3. 12000rpm 4℃离心10min，取上清分装到1.5mL EP管中，每管 0.1-0.2mL；

4. -80℃冰箱冻存。足量干冰寄送。

血浆：200ul

1. 用肝素钠抗凝管（肝素、肝素钠、肝素锂）采集全血，并尽快进行血浆分离；

2. 采血后尽快于3000 rpm（4℃），离心15 min，待血细胞完全沉降都管底后，吸取上层血清，用EP管分装，取上层，每管0.1-0.2mL分装至1.5mL EP管内中；

3. -80℃冰箱冻存。足量干冰寄送。

尿液：1mL

1. 晨起中段尿（临床）或晨间1h尿（动物）直接分装到离心管（进口）中，每管1mL；添加质量体积为1/100（w/v）的叠氮化钠；

2. 收集好的尿液10000-15000转/分钟，于4℃温度下离心10分钟后，吸取中层澄清的尿液，用进口的1.5 mL离心管分装保存，200微升/管，最好保存两管，以保证两次实验的量。

3. -80℃冰箱冻存，足量干冰寄送。

唾液：0.5 mL

禁食禁烟禁酒1h以上

上午9:30-11:30取样，蒸馏水漱口，将唾液外吐于无菌痰杯内（保持冰浴），不要咳痰，收集5-10min，4℃，12000rpm，离心20min，取上清，再经0.22um滤膜过滤除菌，500ul分装，保存于-80℃。

粪便或肠道内容物：200mg-5g

1. 收集到新鲜粪便或肠道内容物样本，从粪便的不同部位挑3个点，称5g/例放到离心管中；

2. 添加一滴（约10uL）质量体积比为1/100（w/v）的叠氮化钠（1mg/ml），分装样本200mg/管；

3. 迅速放入液氮中冷冻处理至少15min；

4. -80℃冰箱冻存。足量干冰寄送。

常规动物组织（心、肝、脾、肺、肾、肠、脑、肌肉等）：200mg最佳

1. 如果组织上有血，先用用生理盐水漂洗掉；

2. 根据具体实验设计取特定的部位，200mg/管装入标记好的离心管中；

3. 迅速放入液氮中冷冻处理至少15min；

4. -80℃冰箱冻存。足量干冰寄送。

第十 三式代谢组的样品重复性有什么要求？

代谢组学基于多元统计分析方法进行的，在样品准备上相对于转录组和蛋白质组而言需要更多的重复数据。

1.         一般建议植物样品：最少6次，建议8次生物学重复；

2.         模式动物及微生物样品：最少8次，建议10次生物学重复；

3.         临床样品：30次生物学重复以上，如组织样品取样不便，可控制在20次重复以上。

第十 四式代谢组普筛研究一般每组多少个平行样本？为什么？

代谢物在不同组织样品中差异较大，为了可靠的统计学以及生物学分析：

1.         微生物与植物样本：每组最小样本数8个；

2.         模式动物最小样本数：10个；

3.         临床样本最小样本数：30个。

第十 五式代谢组中植物样本准备中细胞破壁的方法有哪些？

1. 机械法：处理量大，速度快；例如球磨法、高压匀浆法、X-压榨法和超声波法等；

2. 酶解法：利用水解酶破坏细胞壁中的聚合物成分；例如溶菌酶可水解细菌、放线菌细胞壁上的肽聚糖，纤维素酶可水解植物细胞壁上的纤维素，蜗牛酶可水解真菌细胞壁上的几丁质和甘露聚糖等；

3. 其他方法：包括细胞自溶法、渗透冲击法、反复冻融法、酸碱处理法和表面活性剂处理法等。

第十 六式对于样品中存在易挥发性的物质，在保存是该如何注意才能保证实验时这些物质没有挥发掉？对于样品中存在易氧化的物质应当注意什么？

易挥发性的物质，收集过程中难免会有丢失，如果气体或者极易挥发可采用进样小瓶收集。

含易氧化的物质的样品收集要快，尽量少暴露于空气中，避空保存，有条件可以抽真空。

微生物代谢速度非常快，所以所有的步骤需要尽快完，且每个样本量一样多。

第十 七式动植物组织，细胞，血液，尿液等样本一般能搜到多少种代谢物？

代谢物在不同的样品中，种类各异，一般植物20万种、动物2500种、微生物1500种

在GC-MS平台：血液400左右，尿液600左右，动植物组织或细胞在500到1000+不等，与生物种类有关；

LC-MS平台可以检测到的物质峰可以达到几千甚至上万，但是由于数据库的限制，目前都是做完差异分析后再做定性，一般代谢物会控制在200个左右。

第十 八式质控样本qc的做法和意义

代谢物检测质控主要是为了保证样品检测过程的准确性，对提取或检测过程中差异较大的样品或代谢物质进行分析判断。

例如，检测100个样品中代谢物质，在提取样品之后，从100个样品中各吸取部分样品，先作为一个混和样品。随后，在100个样品的仪器分析的过程中，可以在每20个样品跑样过程中插入检测一个混合样品，最后通过分析混样在前后五六次代谢检测数据稳定性，判断样品的好坏。

实验方法第十 九式GC-MS代谢组为什么要进行衍生化？

气相色谱仅适用于沸点低、热稳定性好的小分子物质的分离分析，对沸点高、挥发性低、热稳定性差、极性强甚至极易挥发的物质往往不能直接进样分析。

生物样本中含有大量的羟基、胺基、羧基、巯基等官能团的物质信息，因此采用适当的衍生化处理方法对于样品的分离分析往往起着十分重要的作用。

样品的衍生化方法的益处有：

1. 将一些不适合色谱分析的物质进行适当的化学处理转化成相应的挥发性衍生物，可以扩大气象色谱的测定范围；

2. 改变同分异构化合物的色谱性能，提高和改善样品的峰形和分离度，克服载体、柱壁对高极性、低挥发样品的吸附。甚至通过特殊的衍生方法，分离手性化合物；

3. 改善待测物质的热稳定性，以提高检测的灵敏度；

4. 改善待测物质的质谱行为，有利于鉴定化合物的结构。

第二十式非模式生物进行生物信息学分析有什么难点，该如何进行？

非模式生物往往生物信息数据量少，不太适合直接进行组学数据统计与分析，一般建议将非模式生物的数据通过同源比对的方式映射到模式生物上，然后再以模式生物的数据进行系统的生物信息学分析。

第二一式代谢组可以精确描述样本内所有可能的代谢物吗？土壤、饲料等非常规物质代谢组的意义如何？如何去设计实验？

土壤中成分非常复杂，如含有营养物质，垃圾物质，动植物残留，微生物等成分。因此，对于，土壤不推荐进行代谢组学研究。

不同的饲料，成分不一，也需要根据饲料的组成的复杂度来判断是否适合于代谢物分析。在适合代谢物研究的基础上，实验设计可以参考动植物代谢组研究。

第二 二式质谱的类型与选择？

色谱与质谱联用实现了从利用色谱进行物质分离到利用质谱进行物质鉴定的整个流程，且色谱，质谱的类型较为广泛。

对于质谱而言，为了实现代谢物的定性与定量两个目的，应该选择不同的仪器进行综合分析。

• 定性分析：可利用核磁共振质谱，高分辨的质谱与三重四级杆质谱一起进行；

• 定量分析：利用基于三重四级杆系统的质谱，如QTrap，则更为准确。

• 常用的高分辨质谱：TOF-MS，Orbitrap-MS；

• 三重四级杆系统的质谱：主要为QTrap与3Q系统的质谱。

第二 三式如何判断一个GC-MS项目结果的好坏？

主要从如下方面考察：

（1）样本的代谢物的提取和检测是否得到足够多的峰；

（2）组间分群是否好。

第二 四式什么是广泛靶标？

广泛靶向：广泛靶向代谢组学既有非靶向代谢组学的优点也有靶向代谢组学的优点。这种广泛靶向的是不需要标准品的，这项技术是在前期已经建立了公共数据库以外的更多的代谢物，他的数据库更加完善，可以检测到更多。

并且这个技术使用的是三重四级杆，这个是使用在靶向代谢组学上的技术，所以说它具有靶向代谢组的优点。

高灵敏度: 通过离子井进行富集 可以检测到很多低丰度的次生代谢物,而非靶技术无法检测到低丰度物质；定性准确：相比非靶技术，广靶利用分子量的同时利用二级谱进行物质定性；

数据库全：每个物种都可以自建数据库，建立属于该物种特有的代谢库。

第二 五式重名现象的两代谢物需要叠加吗？

不应该叠加。另外需要注意的是，重名的代谢物，需要根据保留时间，分子量，分解谱等方法来判断，它们是不是同一个代谢物，如果不是，命名的时候必须予以区别，相应地，在数据分析时候单独对待。

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