脂质组学丨基本流程

以质谱为研究工具的脂质组学分析的一般流程如上图所示，根据所使用的仪器和实验的目的的差异，实验设计大致可以分为三类，分别为：(1) 分离之后检测、(2) 直接检测、(3) 质谱成像。

gas chromatography (GC), high-performance liquid chromatography(HPLC), (ultra-high-performance liquid chromatography (UHPLC), twodimensionalHPLC (2D HPLC), supercritical fluid chromatography (SFC), electrosprayionization (ESI), atmospheric pressure chemical ionization (APCI), atmospheric pressurephotoionization (APPI), matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI),secondary ion mass spectrometry (SIMS), desorption electrospray ionization (DESI), rapid evaporativeionization mass spectrometry (REIMS), high-resolution accurate mass spectrometry (HRAMS), time-of-flight (TOF),ultrahigh-resolution accurate mass spectrometry (UHRAMS), Fourier transform ioncyclotron resonance (FTICR),mass spectrometry (MS), tandem mass spectrometry (MS/MS), multistage tandemmass spectrometry (MSn), selective reaction monitoring (SRM), multiple reaction monitoring (MRM),data-dependent acquisition (DDA), data-independent acquisition (DIA), collision-induced dissociation (CID),higher energy collision-induced dissociation (HCD), ozone-induced dissociation(OzID), electron-induced dissociation(EID), electron-impact excitation of ions from organics (EIEIO), metastableatom-activated dissociation (MAD), charge transfer dissociation (CTD), ultraviolet photodissociation (UVPD), fieldasymmetric waveform ion mobility spectrometry (FAIMS), drift-tube ion mobility spectrometry (DTIMS), traveling wave ionmobility spectrometry (TWIMS).

 

前两种实验设计主要针对离体的脂质提取物进行检测，因此多数需要对生物样本进行样本前处理，之后在通过 (1) 色谱分离进样或者 (2) 直接进样进行质谱检测分析，通常所使用的离子源包括ESI、nanoESI或者MALDI等。接下来，可以根据研究目的的，实验设计可以分为靶向的对预先选择的或者感兴趣的成分进行定性定量分析，以及对存在与生物样本中的所有脂类成分进行非靶向的整体地分析，也就是我们通常说的靶向脂质组学和非靶向脂质组学。

实验设计 (3) 质谱成像主要用于体内分析，检测脂质成分在所给样本（如组织切片）中的空间分布，此方法通常需要很少的样本前处理步骤或者不需要样本前处理。此外，该方法还可以用于采集原位的脂质组学数据，如在手术过程中实时的对组织进行检测分类。

 

对于一个具体的脂质组学的工作流程，通常包括一列不同的步骤，在每个步骤中也需要根据实际情况选择合适的方法和技术。这些步骤大致包括样本前处理，样本离子化，质谱数据采集和数据分析，获得结果用来对感兴趣的生物学问题进行解释。

 

样本前处理：

• 如果使用方法 (1) 和方法 (2) 进行脂质分析，在样本的前处过程中通常要考虑以下几个方面：1. 目标脂质成分的提取，如去除脂蛋白等；2. 加入内标化合物，方便为后续的相对定量或者绝对定量进行样本的归一化；3. 对于组织或者细胞样本要进行均一化，如组织匀浆等；4. 样品衍生化，目的在于提高电离效率，改善MS/MS信息便于区分同分异构体以及定量分析；5. 选择合适的基质方便后续MALDI质谱分析。对于每一项的操作来说，都有很多可供选择的方法，因此研究者需要根据样本的类型以及整个实验的目的选择合适的方法进行样本前处理方法。

• 对于质谱成像来说，由于涉及到在体分析和原位分析，因此前处理的步骤主要包括：选择合适的组织切片准备方法；加入内标物质（如果需要定量分析）；基质的选择（为下一步的MALDI分析）。但是，原位的质谱成像分析则不需要任何的样本前处理步骤。

 

样本的离子化：

• 对于方法(1) 和 方法(2)来说，ESI和nano-ESI是最常用的用于样本离子化的电离源技术，此外还包括一些具有互补作用的电离源如APCI、APPI等，而MALDI在方法(2) 和方法(3) 中最常用的一种电离技术。方法(3) 中常用的电离技术还包括SIMS以及一些可以进行原位分析的敞开式电离技术，如DESI、nano-DESI、LESA等。

 

质谱数据的采集：

• 在质谱分析阶段也有很多选择，选择的依据主要包括：质量分析器（低分辨、高分辨、超高分辨以及质量精度）；在样本采集时，是否只包含一级质谱采集，还是同时需要采集串联质谱（二级或多级，即MS/MS 或 MSn）信息；实验所要求的对脂类物质定性定量分析的程度（准确定量还是相对定量等）。

• 适用于靶向分析的手段包括中性丢失扫描、子离子扫描、SIM和SRM等。适用于非靶向分析的方法包括DDA和DIA等。此外还可以利用离子淌度技术为色谱质谱分析提供多一维的分离，尤其是在分析脂类同分异构体时，可以帮助研究者提供更加准确的信息。

 

数据分析：

• 数据分析方法的选择大多依赖于可用的方法、软件以及用于脂质鉴别的数据库信息。对于质谱成像分析，同样需要使用适当的软件来根据质谱产生的数据生成二维或者三维的图像。最后，需要使用统计学或者生物信息学的方法，对所得到的数据进行数据挖掘，寻找到隐藏于数据内部的信息用来解释实验设计之初多提出的假说，或者回答所要解决的生物学问题。

• 越来越多的研究也要求将脂质组学的数据结果与其他系统生物学（如基因组学、转录组学、蛋白组学、代谢组学额等）的结果进行整合，不仅仅要让脂质组学能够全面的观察到感兴趣的脂质化合物的变化，还要阐释脂质在复杂的分子生物学网络中所扮演什么样的角色。

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