解救你的FFPE样本

stingray928 2018-02-09

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由于文库制备和测序技术的不断进步，对生物库内大量储藏的FFPE组织样本实施高通量测序逐渐变得可能，这无疑吸引了研究者的目光。FFPE样本十分珍贵且不可替代，福尔马林的固定容易使组织中的核酸发生不同程度的降解和分子间的交联，石蜡的高温渗入过程又进一步加速了核酸的降解，保存的时间及环境对样品中的核酸也有巨大影响。高通量测序测序技术的不断进步降低了可靠检测测序突变的频度阈值, 如何从FFPE样本中获得高品质的适合NGS分析的DNA变得异常关键。

困难与挑战

由于福尔马林固定操作，以及样品可能在非理想条件下长时间储存，从FFPE组织样本中提取能符合下游NGS测序质量要求的DNA通常非常挑战。一般来说，从FFPE样本中纯化DNA，分为脱蜡，酶消化，逆转交联，DNA提取几个步骤，每一步都对DNA的质量非常重要。下面让小编来分享来自QIAGEN在应对FFPE样本核酸纯化的独家秘籍，征服FFPE样本不再是口号，而是每人都分分钟就能搞定的小case。

1. 脱蜡要彻底

脱蜡一定要彻底！要彻底！要彻底！重要的事情小编都讲三遍！由于FFPE样本的特殊性，在处理样本的时候比新鲜组织多了脱蜡的过程。不同的脱蜡方法对产物的质量有重要的影响。虽然现在还很多科研工作者使用二甲苯和矿物油等有机溶剂进行脱蜡，但是它还是存在一定问题的，因为二甲苯是一种有毒的有机试剂，不仅容易造成核酸片段化，核酸得率低，而且对操作者的人身安全有一定的威胁性。另外如果组织切片比较厚，超过10 μm，二甲苯等有机溶剂难以渗透，脱蜡效果不彻底。影响后续酶的消化效率。推荐大家使GeneRead FFPE DNA Kit中自带的Deparaffinization Solution这种非有机试剂的脱蜡溶液进行脱蜡步骤，不仅没有了二甲苯等有机试剂的毒性，而且更防止核酸降解，保证核酸的完整性。非常有必要指出的是GeneRead FFPE DNA Kit只需要一片切片组织，就能纯化到0.5ug的DNA，足以进行下游的NGS实验。这和传统的FFPE样本DNA纯化产品相比，是目前市场上起始样本量最低的一款产品。

2. 蛋白酶K组织消化

为了将DNA与结合的蛋白质分离，FFPE样本需经受高温和蛋白酶K消化。蛋白酶K可以消化蛋白质组分以及样品中可能存在的任何核酸酶，这个步骤还可防止DNA发生降解。消化的时间过短，DNA的释放不充分，导致核酸提取的得率低。GeneRead FFPE DNA Kit我们推荐56℃一小时即可完成组织消化步骤。请保证蛋白酶K与组织充分接触！

3. 逆转交联

前面提到FFPE样本制备中，福尔马林的固定作用容易使核酸和蛋白紧密交联。进行组织消化后样品已经变成水化状态，此时需要尽量在温和的环境下促进核酸和紧密交联的蛋白分开，释放DNA。QIAGEN建议在90℃的环境下，孵育样品一个小时，以达到逆转交联的目的。

4. 有效减少人为的 C>T | G>A 转换

由于福尔马林固定操作，以及样品可能在非理想条件下长时间储存，从FFPE组织样本中提取的DNA在发生严重降解的同时，也经常会检测到人为假突变。值得一提的是，胞嘧啶向胸腺嘧啶的转换占低频随机突变的绝大部分比例，进而在序列上分布为不同的突变位点。由于只有少数基因组拷贝上发生了全局性的破坏，因此这些人为产生的假突变的发生频率通常较低。而低频度的新突变在癌症研究中可能携带有十分重要的信息，因此很有必要在这些低频突变中区分真实突变与人为突变。GeneRead DNA FFPE Kit在加热逆转交联后，通过特异性去除脱氨基胞嘧啶残基，最优化的反应混合物提供了这样的条件，特异性地从FFPE样品获得的DNA中去除人为假突变产生的尿嘧啶。

GeneRead DNA FFPE Kit 极大降低了低频发生的 C>T | G>A 转换（人为突变），同时有效保留了真实发生的突变。在分析癌症相关的突变过程中，去除 C>T | G>A 转换的人为干扰显得尤为重要。脱氨作用多为随机发生，如未经有效清除这些人为干扰，它们也可能被解释为具有癌症相关性，进而作为假阳性的突变被显示出来。GeneRead DNA FFPE Kit 仅去除人为突变，从而使假阳性风险降至最低。

从一例1 5 岁病患的肝癌组织中鉴定到的COSMIC突变。对此样本同时使用标准 FFPE 试剂盒和带有人为突变清除步骤的全新GeneRead DNA FFPE Kit进行处理。处理后样本均通过GeneRead DNAseq Comprehensive Cancer Gene Panel进行靶向扩增并使用大规模平行测序技术完成测序。最后两列显示了鉴定得到的突变频率。使用GeneRead DNA FFPE Kit比标准试剂盒多鉴定出四个突变。这些突变均为C>T | G>A 转换的低频突变，很容易与福尔马林固定和储藏过程中发生的人为突变相混淆。所有其他的突变均在两类处理中被成功检出，检出的突变发生频率也十分接近，这表明新试剂盒能够高效消除人为突变，而不会对真实突变造成影响。

更值得一提的是，目前该试剂盒的突出性能也已经被完全整合至QIAsymphony自动化平台 (QIAsymphony GeneRead DNA FFPE Treatment Kit)，简单的脱蜡及假阳性修复过程之后，便可直接进行完全自动化的高质量FFPE DNA过程。

5. FFPE核酸质控

对于下游NGS测序来说，由于测序成本较高，因为前期样本制备阶段因此不仅核酸的得率要高，质量比如纯度和完整性也是大家关注的重点。那怎么进行质控呢？小编也都给大家整理好了。

一种比较常见的方法便是通过简单的浓度测量和片段大小检测，例如基于微流体芯片技术的QIAxpert可快速对于FFPE样本中的核酸浓度及污染物组成进行快速分析，全自动毛细管电泳仪QIAxcel也可利用预装好的试剂卡夹来对FFPE DNA的浓度及片段大小进行全面而快速的分析。

核酸质控“黄金搭档”

另外一类更为准确、全面的质量评估方法便是基于实时定量PCR，针对基因组中一些特定的保守区域，设计不同的定量PCR引物对，根据扩增结果的Ct值结合相应的数据分析算法，对FFPE DNA的浓度、完整性给出精确的评估结果。QIAseq DNA QuantiMIZE Kit便是基于该原理进行FFPE质控的典型代表。试剂盒中所含有多组qPCR引物，可分别针对不同的目标区域生成平均在100bp和200bp的一对扩增产物，结合自带的分析软件，只需简单输入相应的qPCR Ct值，便可自动生成相应FFPE DNA样本的浓度、质控评分，并且会对下游特定应用的核酸使用量给出建议值。这一点对于FFPE样本，特别是完整性很差的FFPE或类似样本的进一步利用具有极为重要的价值。