今天着重为大家介绍目前最最廉价的基因突变检测（SNP）技术---MassARRAY检测技术，因为它是目前检测SNP性价比最最高的技术平台，没有之一。 首先，提到基因突变检测，大家可能都不陌生，关于基因突变检测的方法我之前也有写过： PCR（Polymerase Chain Reaction/聚合酶链式反应） PCR-RFLP（限制性片段长度多态性） ARMS-PCR（amplification refractory mutation system-PCR/扩增阻滞突变系统PCR） DHPLC（denaturing high performance liquid chromatography/变性高效液相色谱法） HRM（High-resolution melting curve/高分辨率融解曲线） PCR-SSCP（PCR-Single strand conformation polymorphismanalysis/聚合酶链反应-单链构象多态性分析） 突变体富集PCR（mutant-enriched PCR） 微数字PCR（Microfluidics Digital PCR） FISH（fluorescence in situ hybridization/荧光原位杂交） Sanger（Sanger sequencing） NGS（Next generation sequencing） TGS（Third generation sequencing）等，今天介绍的就是通量高、成本低、组合灵活、灵敏度高的MassARRAY平台系统。 其次，我来介绍下MassARRAY平台系统的前世今生：Sequenom公司是用高通量芯片技术研究SNPs的旗舰公司之一，推出的世界上领先的基因分析工具MassARRAY 分子量阵列技术，通过引物延伸或切割反应与灵敏、可靠的MALDI-TOF-MS（Matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry/基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱）质谱技术相结合，实现基因分型；在2000年上市的时候创下日涨200%的记录，曾经是“基因组时代”生物技术公司的宠儿，最高时超过$600美金一股。 由于Sequenom公司在其发展的过程中，出现过一系列的问题，最终于2014年6月份将其生物科学业务（bioscience business）出售给了Agena Bioscience公司，所以截至2016年07月26日，目前市场上的产品、试剂和耗材应该都变更为Agena的图标了，但其业务总部仍设在加州圣地亚哥，Agena为了打开中国的市场，在上海市徐汇区枫林路成立了一家大中华区总代理公司（基纳生物技术（上海）有限公司）。 再次，我来介绍下MassARRAY对于SNP和甲基化检测的原理：基于MassARRAY平台的iPLEX GOLD技术可以设计最高达40重的PCR反应和基因型检测，根据应用需要，对数十到数百个SNP位点进行数百至数千份样本检测时，MassARRAY具有最佳的性价比。 飞行质谱的原理是样品分析物与芯片基质（硅化合物）共价结合形成结晶后在质谱仪的真空腔中经高能激光激发，核酸分子解吸附为单电荷离子；在电场中离子飞行时间与离子的质量成反比相关，通过检测解吸的核酸分子在真空腔中飞行的时间从而计算获得样品分析物的精确分子量，进而得到分析物的基因型信息（图1）。该平台使用的是垂直飞行模式。 图1. 飞行质谱工作原理示意图 SNP分型检测原理：单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNP）是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括转换（C/T，G/A）、颠换（C/A，G/T，C/G，A/T）、缺失和插入，数量很多，多态性丰富。目前认为，SNP是指变异频率大于1%的单核苷酸变异。在人类基因组中大概每500-1000个碱基就有一个SNP，人类基因组上的SNP总量大概有3x106个。人类很多表型差异、对药物或疾病的易感性等都可能与SNP有关。 MassARRAY平台的iPLEX检测基因分型的原理是，对PCR扩增的目标序列，进行MassEXTEND单基因延伸反应，该反应是紧挨着SNP位点设计一段探针，在反应体系中以ddNTP替代dNTP，使得探针在SNP位点处延伸一个碱基即终止，在反应体系根据SNP位点的不同，探针将结合不同的ddNTP，生成不同分子量的产物（图2）。延伸的产物与芯片基质结合形成化合物后再通过飞行质谱进行基因型分析。
DNA甲基化检测原理：MassARRAY分子量阵列基因分析系统EpiTYPER DNA甲基化分析技术结合了碱基特异性酶切反应（MassCLEAVE）和MALDI-TOF测序原理。与其他测序方法检测DNA甲基化一样，MassARRAY平台也是应用经过亚硫酸盐处理，DNA中的未甲基化的胞嘧啶（C）转为尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶不会发生改变，甲基化的胞嘧啶和未甲基化的胞嘧啶（转变成U）由于分子量不同，因此可以区分。 利用5，末端带有T7启动子的引物进行PCR扩增，产物经虾碱性磷酸酶（SAP）处理后，转录并进行碱基特异性的酶切反应（MassCLEAVE），最终生成不同分子量的检测产物（图3）。酶切后DNA片段的大小和分子量取决于亚硫酸盐处理后碱基的变化。 图3. EpiTYPER技术检测DNA甲基化原理示意图 从此，再介绍下它的技术特点和相似平台的对比： 1、高通量：一张芯片可对384个样本进行多重检测,每个体系最多可实现40重反应，而且通量可根据客户要求进行个性化调整。 2、高性价比：无需荧光标记，仅需合成普通引物，单个分析成本低；适用范围广，可同时检测几十到成千上万个样本，检测几十到成百上千个位点。 3、高灵敏度：分析所需样本量少，且检测精度高，并能进行定量分析。 4、高灵活度：功能多样，适用于SNP分型以及DNA甲基化定量分析。而且一张芯片上样本数量和位置可随意选择，同时，一张芯片上样本和位点检测匹配也可随意选择。
最后，来介绍下MassARRAY的应用领域：目前该设备系统已经在全球37个国家应用，应用范围覆盖生物学的各个领域，如癌症分析实体瘤和液体活检，遗传病检测，遗传药理学、农业基因组学、临床转化医学研究和法医学研究等。 一、SNP分型质控 案例1：华大基因-耳聋基因检测 华大基因在四年前启动耳聋基因检测，使用的平台就是MassARRAY核酸质谱仪，该项目检测4个耳聋相关基因共20个位点，在一个反应体系内进行。 案例2：达安基因-重大疾病易感基因检测 达安基因通过非医院渠道（保险公司，银行VIP，健康管理公司）开展重大疾病易感基因检测，业务从去年7月份起飞，至今已经检测达5万人份，该项目通过分析肿瘤、高血压和糖尿病等相关基因，共200个多个位点，在10个反应孔里进行。达安基因将进一步在质谱平台上开发肿瘤突变基因检测，地中海贫血基因检测，以及儿童优势基因易感基因检测等项目。 案例3：Agena Bioscience-ADME个体药物代谢基因型检测试剂盒 Agena Bioscience开发的ADME个体药物代谢基因型检测试剂盒包含>99%FDA评估的基因标记物，是目前最为实用的测定药物代谢遗传学的方法。涵盖34个基因中的185个药物代谢标记，包括变异，插入，缺失，拷贝数变异，三等位基因标记等，可以帮助指导个体安全用药和药物研发。其系列产品还包括：1、华法林试剂盒(CYP2C9*2;*3-VCORC1-1639)；2、CYP2D6 v1.1药物代谢试剂盒；3、CYP2C19 Panel1 v1.0药物代谢试剂盒；4、CYP2C9/VKORC1 Panel1 v1.0药物代谢试剂盒。 类似案例还有北京博奥、广州达安基因等服务类公司。 二、SNP位点等位基因频率计算 案例1：2007年由美国哈佛大学医学院Garraway教授领衔，美国、日本、瑞士、奥地利和德国等5国26个机的53名专家参加的联合研究，，在NATURE GENETICS（2007）上首次揭示了人类肿瘤基因突变的频率和分布，为肿瘤分类、发生机制和治疗干预提供了依据。专家们通过将MassARRAY®质谱与两种测序法比较，最终一致选择了高灵敏度和高特异性的MassARRAY®法。结果证明，质谱法检测突变比测序法更灵敏且经济。 案例2：安徽医科大学张学军校长团队，从2009年引进该技术后，已经连续四年在Nature Genetics和N Eng J Med等高影响力杂志发表17篇GWAS研究论文，所有基因频率计算验证工作均在MassARRAY®质谱平台完成，其高效率之高，成为国内乃至国际GWAS研究的典范。张学军校长也为此在“GWAS 2011，机遇与挑战”的国际论坛中与《自然遗传》主编Myles Axton博士一同担任共同主席。 案例3：上海市糖尿病研究所贾伟平教授与韩国、新加坡等联合完成了迄今为止样本量最大的东亚人群2型糖尿病全基因组关联（SNP基因频率）研究，发现了19个可能的潜在易感位点，并最终确认了8个位点GLIS3、PEPD、FITM2-R3HDML—HNF4A、KCNKl6、MAEA、GCCl一PAX4、PSMD6、ZFAND3。 三、体细胞突变检测质控和验证 案例1：中山大学肿瘤医院-肿瘤相关突变基因检测 中山大学肿瘤医院是全国率先单独成立分子诊断科的肿瘤专科医院，他们曾经尝试过各种平台，最后肿瘤化疗相关基因，易感基因及鼻咽癌的筛查均转移到MassARRAY平台上，主要考虑到成本低，操作简单，分析容易，数据结果稳定可靠，开放性等优点。 案例2：陈竺院士和陈赛娟院士团队在中国首先引进该技术，并成功用于SNP和甲基化的研究。在Nature Genetics（2011）发表白血病研究新成果。对9例配对样本,用外显子组测序技术鉴定出266个体细胞突变点和用DNA甲基化免疫沉淀+芯片技术,分析获得3,878基因甲基化变异。继而用MassARRAY® 核酸质谱技术，对509名健康对照和98例病人进行体细胞突变和甲基化定量分析的大样本量验证。证实DNMT3A突变与急性白血病高发病率及预后不良密切相关，提供了一个新的生物标记物。 案例3：2012年英国萨顿癌症研究所Perkins首次从晚期肿瘤病人外周血浆DNA中检测肿瘤体细胞突变:1.从晚期肿瘤病人的外周循环血浆DNA中，成功检出肿瘤体细胞突变，该结果与匹配的石蜡肿瘤组织样本完全吻合。2.总外周循环血浆DNA水平与病人预测生存期相关。3.证实了Sequenom设计优良的OncoCarta™试剂盒，在肿瘤活检不能反复进行时，能通过扫描外周循环血中肿瘤DNA找到肿瘤标志物。Sequenom公司于2008年开发出首个OncoCarta™癌基因体细胞突变检测试剂盒，涵盖文章公认的19个癌基因的238个热点突变，覆盖了90-95%的已知药物靶标，为临床研究试验提供经济有效的突变筛查。 四、甲基化定量分析 案例1：陈竺院士和陈赛娟院士团队在中国首先引进该技术，并成功用于SNP和甲基化的研究。在Nature Genetics（2011）发表白血病研究新成果。对9例配对样本，用外显子组测序技术鉴定出266个体细胞突变点和用DNA甲基化免疫沉淀+芯片技术，分析获得3,878基因甲基化变异。继而用MassARRAY® 核酸质谱技术，对509名健康对照和98例病人进行体细胞突变和甲基化定量分析的大样本量验证。证实DNMT3A突变与急性白血病高发病率及预后不良密切相关，提供了一个新的生物标记物。 五、基因表达定量分析 案例1：美国Sequenom技术创始人美国科学院院士Charles Cantor博士，从1992年发明免疫PCR，历经20年首次发表多重免疫PCR检测。该技术将免疫PCR结合竞争性PCR和多重PCR定量检测蛋白质（抗原或抗体），其灵敏度较传统蛋白质检测方法提高100倍，也就是将样本的需求量降低10到100倍。 六、CNV检测分析 案例1：卢煜明教授，采用其CNV检测技术，率先在《自然—医学》（Nat Med 2007）杂志发表重大研究成果─唐氏綜合症无创性产前测试，开拓了无创性产前诊断新里程。 |
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