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靶向联合治疗的第一个挑战是如何发现最有效的组合。通过小规模的临床假设检验研究，可以发现一些有效的药物组合，比如用MEK以及AKT抑制剂联合靶向治疗KRAS突变肿瘤(Tolcher et al., 2015a)。但临床假设检验研究通量较低，面对复杂多变的突变模式，显得力不从心，需要发展新的研发方法。 无偏向的高通量筛选 许多新的以及超出预期的药物组合都是通过无偏向、高通量的体系筛选出来的(Al-Lazikani et al., 2012)。在肿瘤细胞系上，将FDA批准的药物，以组合的方式针对不同readout进行高通量筛选，已经发现了许多意想不到的药物协同作用。 例如抗寄生虫药物pentamidine与抗精神病药物chlorpromazine在体外肿瘤细胞系中被证明具有协同抗有丝分裂活性(Lee et al., 2007)。但该方法也存在缺乏或忽视药物机制的缺陷，比如作用于细胞外的驱虫药物可能在体外具有抗肿瘤活性，但它不太可能用于人身上去观察体内活性。 除了化学药物，还有一类是基于基因的无偏向、高通量筛选，比如有报道在FGFR3突变并对FGFR抑制剂产生抗性的肿瘤细胞系中进行genome-wide RNAi筛选。在筛选中发现，对EGFR进行干涉后，FGFR抑制剂对该细胞系重新致敏，从而证明EGFR激活是导致FGFR3突变肿瘤对FGFR抑制剂产生抗性的一个机制(Herrera-Abreu et al., 2013)。 合成致死效应以及siRNA筛选 合成致死效应是一个在果蝇研究中出现的概念，用于描述细胞中存在的两个或更多基因的同时突变，那么同时这些突变的组合会导致细胞死亡。肿瘤细胞有不同于正常组织的特异突变，在此突变的基础上进行+1突变的筛选，可以筛到具有合成致死效应的组合，从而推断治疗某种肿瘤的药物，由于正常细胞或其他类型癌细胞不具有该肿瘤细胞的某个特异突变，所以通过合成致死筛选发现的药物只对具有某个特异突变的肿瘤细胞有杀伤作用，对正常组织毒性作用较小(McLornan et al., 2014)。 一个非常有名的例子是2012年报道的发现治疗KRAS突变的非小细胞肺癌药物的过程(Kumar et al., 2012)。研究者分别在KRAS野生型以及KRAS突变的非小细胞肺癌细胞系中通过siRNA敲低了7000个基因的表达，发现敲低转录因子GATA2会特异性导致KRAS突变癌细胞死亡。虽然GATA2本身不是一个可作用的药物靶点，但是通过组学研究发现，GATA2在细胞中主要参与调控了蛋白酶体调控的NF-KB通路以及RHO/ROCK信号通路。用蛋白酶体抑制剂bortezomib以及ROCK抑制剂fasudil联合治疗，几乎完全缓解了KRAS突变驱动的肿瘤在小鼠模型中的进展。 siRNA的筛选是发现新靶点的有力工具，但也存在一些局限，比如siRNA的脱靶效应、干涉只能有限的降低某个基因的表达而不是完全的敲除、干涉一个蛋白并不能完全模拟靶向药物的作用等(Mohr et al., 2014)。CRISPR-CAS9技术的兴起可能可以部分补足siRNA的一些缺陷(Shi et al., 2015)。 系统生物学 系统生物学方法是指通过生物大数据的挖掘，找到联合用药的可能，这些数据可以是基因组、转录组、蛋白组、翻译后修饰以及表观遗传等(Creixell et al., 2015)。在melanoma治疗领域，由于没有有效的NRAS抑制剂，对NRAS突变的melanoma一直缺乏有效的治疗药物。 有一项研究报道，在melanoma中对NRAS进行敲除，模拟NRAS抑制的效果。同时与只用MEK抑制剂处理的野生型细胞进行转录组对比，发现MEK抑制剂处理的细胞与NRAS抑制后的细胞存在很大不同。 虽然两者都显著激活了凋亡通路，但是在细胞周期通路上却存在很大差异，即MEK抑制的野生型细胞的细胞周期通路还处于激活状态，但NRAS敲除的细胞却大多处于细胞周期抑制状态。进一步的分析发现，CDK4是导致这些差异存在的驱动基因，用MEK以及CDK联合抑制后细胞的转录组与NRAS抑制后的细胞就相似很多。从而推断出用MEK、CDK4抑制剂联合处理来模拟NRAS抑制，用于治疗NRAS突变癌细胞(Kwong et al., 2012)。随着计算机算法的深入推进，人工智能也许将来会在药物筛选领域大放异彩。 患者原代肿瘤细胞模型 众所周知，药物研发领域长久以来使用最多的就是肿瘤细胞系，但这些细胞系的遗传背景可能与患者的肿瘤样品存在巨大的差异(Domcke et al., 2013)。所以研究者尝试在体外建立患者来源的原代肿瘤细胞模型(PDC model)。 在一个比较有名的例子中，研究者发现肺癌患者经常会产生ALK抑制剂抗性，通过分离肺癌患者手术样本，并在体外培养物中不断用ALK抑制剂对细胞进行处理，可以成功建立对ALK inhibitor产生抗性的细胞培养物。通过对几十种激酶抑制剂的筛选，研究者发现ALK与SRC联合抑制，对大多数ALK驱动的肺癌样品都有效，而这一联合用药方式却很难用大数据分析的方法发现，体现出原代肿瘤细胞模型的特殊价值(Crystal et al., 2014)。 除此之外还有PDX模型。由于PDX可以更忠实的反应肿瘤本身的细胞异质性，所以理论上它是目前为止研究肿瘤生物学以及产生抗性机制的最有力工具(Tentler et al., 2012)。 比如研究者利用PDX模型，发现用EGFR抑制剂治疗患者，会快速产生ERK1/2reactivation；如果在治疗伊始就用EGFR与MEK抑制剂联合治疗，可以有效延缓抗性的产生，并完成在小鼠中对肿瘤的治愈。如果进一步出现对MEK以及EGFR双抑制产生的抗性，可以再联合使用AKT/mTOR抑制剂的三联治疗方法(Tricker et al., 2015)。 i- CR技术平台是基于CR（条件性重编程conditional reprogramming）原理研发出的新一代肿瘤原代细胞培养技术。构建了一套全新的培养体系，能够让上皮来源的肿瘤原代细胞突破传代限制。培养的肿瘤原代细胞不仅可以帮助科学家们更好地理解疾病的分子机理，产生原因，还可以协助药物发现和新疗法的开发。 Reference: Al-Lazikani, B., Banerji, U., and Workman, P. (2012). Combinatorial drug therapy for cancer in the post-genomic era. Nat Biotechnol30, 679-692. Creixell, P., Reimand, J., Haider, S., Wu, G., Shibata, T., Vazquez, M., Mustonen, V., Gonzalez-Perez, A., Pearson, J., Sander, C., et al. (2015). Pathway and network analysis of cancer genomes. Nat Methods 12, 615-621. Crystal, A.S., Shaw, A.T., Sequist, L.V., Friboulet, L., Niederst, M.J., Lockerman, E.L., Frias, R.L., Gainor, J.F., Amzallag, A., Greninger, P., et al. (2014). Patient-derived models of acquired resistance can identify effective drug combinations for cancer. Science 346, 1480-1486. Domcke, S., Sinha, R., Levine, D.A., Sander, C., and Schultz, N. (2013). Evaluating cell lines as tumour models by comparison of genomic profiles. Nat Commun 4, 2126. Herrera-Abreu, M.T., Pearson, A., Campbell, J., Shnyder, S.D., Knowles, M.A., Ashworth, A., and Turner, N.C. (2013). Parallel RNA interference screens identify EGFR activation as an escape mechanism in FGFR3-mutant cancer. Cancer Discov 3, 1058-1071. Lee, M.S., Johansen, L., Zhang, Y., Wilson, A., Keegan, M., Avery, W., Elliott, P., Borisy, A.A., and Keith, C.T. (2007). The novel combination of chlorpromazine and pentamidine exerts synergistic antiproliferative effects through dual mitotic action. Cancer Res 67, 11359-11367. Kumar, M.S., Hancock, D.C., Molina-Arcas, M., Steckel, M., East, P., Diefenbacher, M., Armenteros-Monterroso, E., Lassailly, F., Matthews, N., Nye, E., et al. (2012). The GATA2 transcriptional network is requisite for RAS oncogene-driven non-small cell lung cancer. Cell 149, 642-655. Kwong, L.N., Costello, J.C., Liu, H., Jiang, S., Helms, T.L., Langsdorf, A.E., Jakubosky, D., Genovese, G., Muller, F.L., Jeong, J.H., et al. (2012). Oncogenic NRAS signaling differentially regulates survival and proliferation in melanoma. Nat Med 18, 1503-1510. McLornan, D.P., List, A., and Mufti, G.J. (2014). Applying synthetic lethality for the selective targeting of cancer. 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Tricker, E.M., Xu, C., Uddin, S., Capelletti, M., Ercan, D., Ogino, A., Pratilas, C.A., Rosen, N., Gray, N.S., Wong, K.K., et al.(2015). Combined EGFR/MEK Inhibition Prevents the Emergence of Resistance in EGFR-Mutant Lung Cancer. Cancer Discov 5, 960-971. |
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