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2月28日，来自英国爱丁堡大学的研究人员在Nature Communications杂志在线发文使用宏基因组binning 和基于Hi-C的proximity-guided组装，从43只苏格兰牛的超过800 Gb的牛瘤胃的宏基因组测序数据中组装得到913个细菌和古细菌的基因组草图， 这些数据集大大提高了公共数据库中瘤胃微生物基因组的覆盖范围，也是生物质降解酶和瘤胃微生物群研究的宝贵资源。  点击文末的“阅读原文”查看论文全文 瘤胃作为牛的消化器官，能将植物材料分解为能量，而这主要由瘤胃中的微生物系统所编码的酶完成。该研究得到的基因组中，大多数都是先前未被测序的菌株或菌种。基因组草图中预计有超过69,000种蛋白质参与碳水化合物的代谢，其中90％以上在公共数据库中尚未有很好的匹配。 Fig1：在图中可见几个大分支。该树由代表梭菌属和类杆菌属的两个大簇代表，其中后者的一个重要簇代表Prevotellaceae。较小的进化枝代表变形杆菌，古细菌，放线菌，螺旋体和纤维杆菌。其余节点和分支代表杂菌。 首先，利用Illumina HiSeq 4000测序，从42个从苏格兰牛的瘤胃微生物群中产生了768Gb数据，分别对每个样品和所有样品进行宏基因组组装，创建了一组去重的putative genome bins ，完整度≥80％，估计污染度≤10％ 。分析得到850个MAG，在Supplementary Data1 中可以看到850个MAG的分布。 然后，又对第43个样品进行测序，使用ProxiMeta Hi-C技术将 assembled contigs 聚类为基因组。Hi-C分析产生了另外63个基因组草图（完整性≥80％，污染率≤10％）。注：Bowers等人2017年发表在Nat Biotechnol上的研究将高质量MAG定义为完整性> 90％，污染<5％。而这项研究得到的基因组中有491个符合这些标准; 另外，有215个基因组的完整性=""> 95％，污染<5％；30个基因组的完整性> 97％完整性，0污染。 在下文中，这两次得到的基因组分别被称为RUG（Rumen Uncultured Genomes）和hRUG（Hi-C Rumen Uncultured Genomes）。 Fig3: Distribution of the maximum percentage identity of the RUG proteins against five public databases for six classes of carbohydrate-active enzymes. GH glycoside hydrolase, GT glycosyl transferase, PL polysaccharide lyases, CE carbohydrate esterases, AA auxiliary activities, CB carbohydrate binding 其中，7个RUG能对应到种。 RUG346是地衣芽孢杆菌的菌株，RUG287是Kandleria vitulina的菌株，RUG405是发酵氨基酸球菌的菌株，RUG618是Megasphaera菌株的菌株。 （与菌株DJF_B143最相似），RUG133是一种双歧杆菌（Bifidobacterium merycicum）菌株，RUG664是一种马链球菌（Streptococcus equinus）菌株。其余的906个RUG中，至少有158个可以对应到属，至少416个到科，841个到目，845个到纲，895个到门，906个到界。 28个RUG代表古菌，补充数据6显示了597个公共古菌基因组的情况。 在可解析到门水平的RUG中，厚壁菌占优势（50％），其次是拟杆菌（36％），放线菌（3.5％），变形菌（3.1％），广古菌（3.1％）和螺旋体（1％），代表在瘤胃中发现的最主要的微生物门。整个MAG和Hi-C基因组中门的分布非常相似。 碳水化合物活性酶数据库（CAZy database）定义了六类涉及碳水化合物代谢的酶。该研究中得到的913个RUG含有1,979,391个蛋白序列。使用dbCAN对这些数据在CAZy数据库中进行过滤。 预测结果是，总共69,678个序列具有至少一个碳水化合物活性功能，在这些蛋白质中，只有6061个（8.7％）在上述已有数据库中具有高度相似的匹配（≥95％的同一性），这表明研究者预测的碳水化合物活性蛋白质中的63,617个可以被认为是新的。 总的来说，算上具有多个结构域的蛋白质，RUG中共包含40,140个GH，19,722个糖基转移酶，1121个PL，9119个CE，154个具有AA的蛋白质和2545个CB蛋白质。这些酶在913个RUG中的分布可以在图2和补充数据中看到。 Fig4: Classification rate for three datasets against various Kraken databases. BFAP bacterial, archaeal, fungal and protozoan genomes from RefSeq, BGEB BFAP + 1003 GEBA genomes, BHIC BFAP + 63 hRUG genomes, BHUN BFAP + 410 genomes from the Hungate 1000 project, BRUG BFAP + 850 RUG MAGs, BRHI BFAP + all 913 genomes from this study, BRHH BFAP + 913 RUGs + 410 Hungate 1000 genomes. Addition of rumen-specific RUGs or Hungate 1000 genomes has the most dramatic effect 为了解RUG蛋白与公共数据库中蛋白的差异，我们绘制了每种CAZy酶类best hit 的氨基酸同一性百分比（图3）。平均而言，预测的GHs，GTs，PLs，CEs和CB蛋白在氨基酸水平上与目前公开可用的序列在65％至72％之间相同。 AA类更保守，中位氨基酸同一性约83％。 作者还研究了RUGs产生纤维素酶的能力（这是一种负责降解木质纤维素生物质的多酶复合物）、潜在的多糖利用位点（PUL）、对已有数据集的扩充等。 另外，如前所述，如前所述，Hi-C分析产生了63个基因组，完整度≥80％，污染度≤10％。研究者使用与MetaBAT2输入相同的程序集并进行了宏基因组binning。这导致76个基因组使用相同的cut-off值（补充数据17）。然而，我们假设Hi-C基因组可能含有更多不符合原始细胞基因组标准的遗传元件拷贝，例如，质粒经常以多个拷贝存在，并且通常具有不同的碱基组成核心基因组。由于像MetaBAT这样的算法同时使用碱基组成和覆盖范围，因此MAG通常缺少质粒。 为了寻找多拷贝质粒的存在，研究者从每类基因组（63个Hi-C基因组和76个SPAdes / MetaBAT基因组）中提取那些> 2×平均覆盖度的contigs ，得到来自Hi-C基因组的243个contigs 和来自SPAdes / MetaBAT基因组的37个contigs 。比对nt数据库发现，SPAdes / MetaBAT组中没有可以注释为’质粒’的contigs ，而Hi-C组中有10个 （来自10个不同的基因组）。 Fig2: Distribution of carbohydrate-active enzyme classes across the 913 RUGs. GH glycoside hydrolase, GT glycosyl transferase, PL polysaccharide lyases, CE carbohydrate esterases, AA auxiliary activities, CB carbohydrate binding. 在这项研究中，我们了解到RefSeq database在帮助从瘤胃微生物群中读取分类上非常差，因而只有对瘤胃微生物进行测序，才能得到分类的改进。通过该研究以及Hungate 1000，瘤胃微生物分类率提高了5到7倍。该研究得到的913 MAGs将会改变我们对瘤胃宏基因组学数据的解读方式。 未来， Pacific Biosystems和Oxford Nanopore提供的新测序技术能够生成更长的reads，期待杂交短reads和长reads测序能够使宏基因组实现染色体水平的end-to-end 组装，彻底改变我们对复杂微生物组的理解。 /End. |
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