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导语：糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常见的微血管并发症之一，也是终末期肾病的主要病因，全球成人发病率约为9%。 目前我国DN患病率已超过慢性肾小球肾炎，成为城市住院慢性肾脏病的首位病因。据估计，2025年全球糖尿病患者将达30亿，而其中30% - 40%的1型糖尿病和15%～20%的2型糖尿病患者将发生DN。目前，尿微量白蛋白是临床诊断DN的主要指标，但其检测结果易受多种因素影响，如高脂肪摄入、剧烈运动、胰岛素抵抗、高血压、尿路感染等。此外，由于DN起病隐匿，部分患者虽已发生晚期肾脏病理改变，但尿微量白蛋白水平仍在正常范围内。因此，寻找更加灵敏、可靠的分子标志物，对DN的早期诊断和预防具有重要意义。近年来，基因组学、表观遗传组学、转录组学、蛋白质组学及代谢组学等组学技术和高通量筛选技术迅速发展，为DN生物学标志物的探索提供了更多思路。 1 基于肾脏结构的生物学标志物分类 糖尿病引起的高血糖可使肾脏结构和细胞受损，影响肾小球滤过和重吸收等生理功能。尿液中多种生物学标志物水平的升高早于尿微量白蛋白，且与疾病严重程度相关，在DN早期无创诊断、疗效判定及预后评估中发挥重要作用。 1.1 肾小球相关生物学标志物 DN发生肾小球损伤的重要特征是肾小球过滤屏障功能受损，尿液中出现生理情况下不能透过屏障的物质，如白蛋白、转铁蛋白和免疫球蛋白等。足细胞是一种位于肾小球基底膜外表面的脏层上皮细胞，受损时可引起自身肥大、增殖、脱落和丢失，在DN发生、进展过程中发挥重要作用。常见的足细胞标志物有足细胞标记蛋白( podocalyxin)、肾病蛋白(nephrin)、膜蛋白(podocin)和突触足蛋白( synaptopodin)等。足细胞易在DN患者尿沉渣中检测到，常用于监测疾病活动度。此外，足细胞受损还与局灶性节段性肾小球硬化、IgA肾病和狼疮肾炎等疾病活动性相关。podocalyxin并非仅在足细胞表达，内皮细胞、顶叶上皮细胞和各种非肾细胞（血小板和造血干细胞）等也有表达。见表1。  1.2 肾小管相关生物学标志物 肾小管上皮细胞是肾小管最为重要的功能细胞。长期高血糖状态下，肾小管上皮细胞受损脱落，不仅使尿液中中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinaseassociated lipocalin，NGAL)、肾损伤分子1(kidneyinjury molecule-l，KIM-1)等标志性蛋白含量增加，还可使肾小管重吸收功能受到影响，使尿液出现生理情况下应被重吸收的ai微球蛋白(aimicroglobulin，al-MG)、胱抑素C、β2微球蛋H c132microglobulin，p2-MG)等。见表2。  1.3 肾小球系膜区或肾小管基底膜和细胞外基质相关生物学标志物DN的重要特征是肾小管基底膜和肾小球系膜区细胞外基质的过度沉积，最终导致肾纤维化。因此，尿液中与肾小球或肾小管基底膜和细胞外基质相关的生物学标志物水平在DN早期即可增高。见表3。  2基于不同发病机制的分子标志物 DN发病机制较复杂，患者临床表现异质性较大。基于不同发病机制的分子标志物在DN的诊断及个体化治疗中具有重要意义。 2.1 炎性反应相关生物学标志物 炎性反应在DN的发生及进展中起重要作用。DN患者起病前数年常存在低水平炎症状态，尿液中炎性反应标志物水平增高，且与糖尿病患者早期肾功能进行性下降有关。见表4。  2.2 氧化应激相关生物学标志物氧化应激是DN的重要致病因素。高血糖诱导细胞超氧化物上调，并激活糖尿病并发症相关通路，如多元醇通路活化，晚期糖基化终末产物过量产生和蛋白激酶C亚型激活等。见表5  3 遗传学标志物 1型和2型糖尿病患者肾脏并发症均呈明显的家族聚集性。部分有糖尿病易感性的家族并无DN发生风险，提示DN发病机制中存在有别于糖尿病本身的遗传因素。寻找可作为DN生物学标志物的遗传变异，对DN高危人群的预防、早期诊断和治疗有重要意义。目前，DN遗传学标志物研究主要包括候选基因解析和全基因组连锁分析。 3.1 候选基因解析候选基因解析是指以DN发病机制为切入点，探究可能参与致病功能蛋白的编码基因突变或变异是否与疾病相关。Mooyaart等分析671例患者的候选基因，发现34个候选基因变异与DN相关，且具有可重复性。但受当前对DN分子机制研究的限制，即使最有可能致病的候选基因，也仅可解释DN遗传变异的5%，且在统计分析过程中，差异显著性小，效能不足。 3.2 全基因组连锁分析 染色体3q区域富含DN易感基因位点，如酪氨酸激酶非催化区衔接蛋白1和跨膜蛋白22均在肾小球表达，与DN发生、发展密切相关。对不同种族人群糖尿病家系是否易感肾病的研究结果显示，DN与染色体7q、lOp、14q和18q呈强烈连锁相关。 4组学新技术在DN诊断与预后中的作用 4.1 基因组学基因组学研究包含入类整个DNA序列，其中通过研究单核苷酸多态性遗传标志来探索疾病易感性的全基因组关联研究备受关注。Maeda等报道了多个DN新致病基因位点，如SI。C12 A3、ELM01等，但有待在其他种族的研究中进一步验证。尽管全基因组关联研究迅速发展，但基因组学产生的大量数据在进行统计分析时，由于对产生的假阳性结果过度关注，而假阴性结果不易发表，因此极易造成偏倚。此外，基因组学结果解读需结合性别特异性变异、父系年龄效应、环境因素及其他尚无法确定的变量综合考虑。 4.2表观遗传组学 表观遗传学本质上是指通过染色体区域结构的适应性调整，来储存、保持并回忆过去的经历，达到塑造现在和未来行为的目的，有调控DN遗传易感性效应。表观遗传标志物对DN等复杂疾病的遗传易感性至关重要。有学者对糖尿病发生终末期肾病和糖尿病未发生终末期肾病的非裔美国人和西班牙人的表观遗传组学进行研究，结果发现187个差异甲基化的基因。但表观遗传的改变可能是疾病发生的原因，也可能是疾病造成的结果，因此对基因功能信息和相关信号通路的解读极为重要。此外，对全基因组关联研究不会造成影响的环境、年龄、吸烟行为等混杂因素在表观遗传组学研究时需进行考虑和校正。 4.3 转录组学作为基因组学的补充，从分子层面检测转录本或转录组的改变对DN的研究有更大意义mRNA测序技术可绘制整个转录组图谱，包括不同的剪切变异体和非编码RNA等，可逐渐替代传统的微阵列芯片技术。Hodgin等采用肾穿刺活检组织进行转录组学研究，发现Janus激酶、信号转导及转录激活因子、血管内皮生长因子受体2、缺氧诱导因子1等在DN患者中明显升高。但由于转录组数据量庞大，而从mRNA水平至下游蛋白质功能的改变极为复杂，因此对分子靶点的探寻也并非易事。与尿液和血液标本检测结果比较，组织标本检测结果可信度较高，但肾穿刺活检并非DN患者的必要方法，即使取得肾组织，由于其细胞类型异质性大，常规用于肿瘤细胞的单细胞扩增技术也并不适用。因此制约性的突破有赖于利用显微切割技术，对肾穿刺标本生物信息差异大的肾小球和肾小管进行分离。 4.4蛋白质组学 蛋白质组学是基因组研究最主要的部分，是研究DN诊断和预后的重要工具。蛋白质组学主要分为两种：一种是“完全”蛋白质组学，目的是检测一种类型细胞或一种组织内基因组表达的所有蛋白质；另一种是“差异”蛋白质组学，主要是筛选和鉴定不同种类或状态下各样本间蛋白质组的区别与变化，通过与后续质谱和高通量筛选结合可分离、鉴定蛋白，弥补了传统检测蛋白方法对特定抗体的依赖。Ben等应用蛋白质组学法进行研究，发现DN患者尿液中34种蛋白表达增加，34种蛋白表达下降。Alkhalaf等研究结果显示，443种尿液蛋白肽段中约50%含有工型胶原ai和Ⅲ型胶原α1片段。后续临床试验结果证实，尿液中工型胶原和Ⅲ型胶原片段可能是比尿微量白蛋白更早期、特异性更高的生物学标志物。蛋白质组学也存在不足，如部分研究仅描述了疾病组和对照组的多肽模式差异，结果缺乏实用性；一些研究结果呈现一致性差异或未对筛选结果进行验证。因此，利用蛋白质组学筛选出可应用于临床的理想标志物还需进一步研究。 4.5代谢组学 生物体在受到内在或外在因素刺激而发生内源性代谢变化时可产生一些关键化合物，对其进行定性和定量分析，可系统全面、实时动态反映机体受到生物刺激或遗传影响时发生的代谢改变。因此，代谢组学是所有组学技术中最接近疾病过程本质的一项技术。Gong等对DN小鼠模型进行代谢组学研究，发现DN小鼠花生四烯酸、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和还原性谷胱甘肽等表达明显降低。目前人类对复杂的代谢组的认知较有限，而代谢物在不同的生理和病理状态下又存在较大差异，极易受食物、药物等干扰，且并非所有代谢物均来源于机体自身。因此，代谢组学研究的应用尚面临挑战。 5 结语 DN发病机制复杂，并相互调控，不能简单的将其拆分后进行独立研究，而更应运用“系统生物学”思想，多层面、多角度进行考虑。理想生物标志物应具备高度灵敏、特异、无创、易获取、性质稳定等特征。组学和高通量筛选等新技术为DN理想标志物的筛选提供更多的思路。开展分子标志物研究对DN早期诊断、疗效监测及预后评估有重要意义，同时也为发病机制的研究和治疗靶点的探寻提供新的线索，更有助于靶向个体化精准医疗的实现。 作者简介 朱晗玉，副教授，副主任医师，哈佛大学医学院博士后，研究生导师，解放军总医院肾脏病科副主任，首都十大杰出青年医生，北京市科技新星；中国女医师协会肾脏病及血液净化专家委员会常委兼秘书长，北京市医学会肾脏病青年委员会副主任委员；《Journal ofCirculating Biomarker》杂志、《中华实用诊断与治疗杂志》编委，《中华肾病研究电子杂志》编辑室副主任兼编委。主要研究方向：糖尿病及糖尿病肾病的临床和基础研究。承担国家重点研发计划1项，国家自然科学基金2项，北京市科委课题2项，参与国家级科研课题6项。在糖尿病及肾脏病顶级期刊《Diabetes》等国内外著名期刊发表论文40余篇，副主编及参编专著6部；获国家科技进步创新团队奖1项，国家科技进步二等奖1项，中华医学科技进步一等奖2项。 |
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