RNA错剪接与疾病

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导语

人类转录组是由一个庞大的RNA集合组成，它们经过RNA剪接进一步多样化。在这个巨大的序列池中负责监测序列特异性剪接位点由主要剪接体(major spliceosome)和少数剪接体(minor spliceosome)及其大量的剪接因子相互作用完成。剪接复合物功能属性决定了它对于序列多态性和缺失突变较为敏感。RNA错剪接（RNA mis splicing）引起了大量的人类疾病。本文通过讨论疾病相关的错误阐述RNA剪接机制以及突变引起剪接体调控的抑制，探讨调控间接治疗的策略。

RNA剪接（RNA splicing ）简介

RNA剪接（RNA splicing）：从DNA模板链转录出的最初转录产物中除去内含子，并将外显子连接起来形成一个连续的RNA分子的过程。

内含子内特定腺苷的2'羟基攻击5'剪接位点，从而形成一个套索。5'外显子的3'羟基新亲核基于3'剪接位点引发第二次的交酯化/转酯化反应，从而将两个外显子接合。

无论是对组成型剪接还是对可变剪接而言，剪接位点的识别是一个核心问题。剪接位点的确定和剪接调控主要由2个异常活跃的大分子机器来完成：

主要剪接体(major spliceosome)：U2型依赖，它由U1、U2、U4、U6和U5 snRNPs 组成，识别一类相对罕见的GT-AT类内含子(即U2 类内含子)

少数剪接体(minor spliceosome)：U12型依赖，它由U11、U12、U4atac、U6atac和U5 snRNPs 组成，识别一类相对罕见的AT-AC类内含子(即U12 类内含子)

剪接位点的识别受到许多顺式调控元件与反式调控因子的控制。顺式调控元件通常是很短且保守的RNA顺序，它们普遍存在于基因组中。根据它们在基因中的位置以及对剪接的作用，分为外显子剪接增强子或抑制子(exonic splicing enhancer or silencer,ESE or ESS)以及内含子剪接增强子或抑制子(intronic splicing enhancer or silencer,ISEorISS)。在对顺式调控元件进行的早期研究中，主要采用对报告基因进行突变分析的方法。

在大多数情况下，反式调控因子能够结合存在于mRNA前体中的顺式调控元件，在mRNA前体上形成复合物，并通过改变剪接体在mRNA前体上的组装达到对剪接位点进行高度特异性地识别。目前已知的剪接调控蛋白有SR蛋白家族、核不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNP)家族以及诸如TIA-1、Fox1/2、Nova1/2、CELF、RBM5、YB-1等蛋白。SR蛋白家族成员是由位于氨端的一个或二个RNA识别结构域(RNA recognition motifs，RRMs)和位于羧端的富含丝氨酸和精氨酸的RS结构域(RSdomain)组成的。SR蛋白可与富含嘌呤的剪接增强子结合，促进U1和U2snRNP与剪接位点的结合，并招募U4/U6/U5snRNP三聚体到剪接体上。hnRNP蛋白家族成员都拥有RNA识别结构域(RRMs)和由氨基酸簇所构成的辅助区域。hnRNP蛋白通常识别剪接抑制子，从而抑制剪接位点的选择和利用。mRNA前体的二级结构也会对剪接位点的选择产生影响。RNA的二级结构可以暴露或遮掩剪接信号或顺式调控元件，或通过影响剪接调控元件之间的距离调控剪接位点的识别变外显子两侧的序列相互配对，形成“茎环”结构，使处于环部的外显子顺序不被剪接体所识别。

可变剪接的方式

可变剪接主要有7 种方式：(1)外显子的包含和跳跃；(2)5'剪接位点的选择性利用；(3)3'剪接位点的选择性利用；(4)外显子互相排斥地引入；(5)内含子去除或保留；(6)启动子和第一个外显子的可变剪接；(7)多聚腺苷位点与最后一个外显子的可变剪接

疾病相关的剪接体改变

《RNA mis-splicing in disease》，Nature Reviews,doi:10.1038/nrg.2015.3 Published online 23 Nov 2015

可变剪接是增加基因组多样性的重要机制，也是在生理与病理条件下调控哺乳动物细胞基因表达的重要步骤。越来越多的数据显示剪接调控的紊乱与疾病的发生密切相关。

Lamin A(LMNA) pre-mRNA异常剪接与多种遗传疾病相关。正常外显子以蓝色表示，内含子以厚黑线表示，正常剪接以薄黑线表示，疾病相关的剪接以点线或者紫条表示（内含子残留）

a，b，c，b代表4种遗传疾病由特定剪接位置的突变改变了单一外显子的错误剪接造成。

在肿瘤中剪接体失调

可变剪接是增加基因组多样性的重要机制，也是在生理与病理条件下调控哺乳动物细胞基因表达的重要步骤。越来越多的数据显示剪接调控的紊乱与疾病的发生密切相关。

做图为主要剪接体：剪接步骤、核心剪接体组分，它们与剪接前体复合物（complex A）和剪接体（complex C）

右图为次要剪接体：剪接步骤、核心剪接体组分，它们与剪接前体复合物（complex A）和剪接体（complex C）

mRNA前体加工因子3（Pre-mRNA processing factor 3 ，PRPF3），mRNA前体加工因子4（Pre-mRNA processing factor 4 ，PRPF4），mRNA前体加工因子6（Pre-mRNA processing factor 6 ，PRPF6）,mRNA前体加工因子8（Pre-mRNA processing factor 8 ，PRPF8）,mRNA前体加工因子31（Pre-mRNA processing factor 31 ，PRPF31）为U4/U6.U5三小核糖核蛋白组成成分，在常染色体显性视网膜色素变性（autosomal dominant retinitis pigmentosa，adRP)中失调。SNRNP200螺旋酶在剪接体循环中的几个解离步骤中是必须的。几种PRPF组分在the U4/U6.U5 tri-snRNP和the U4atac/U6atac.U5 tri-snRNP complexes中相同的。U4atac snRNA的5’茎环突变在严重的发育障碍——称为Taybi-Linder综合症或microcephalic osteodysplastic primordial dwarfism 1（是家族性侏儒的一型，表现有小头畸形、精神发育不全、出生时体重不足、骨的异常，特别是手足的长短骨），和一种遗传性肠息肉病Peutz-Jeghers综合症。应激诱导p38 MAPK的上调会导致U6atac稳定性的增加（t1/2 <2 hours）。

共转录因子召募和疾病突变

a）剪接因子在核质识别并结合到RNA聚合酶II（RNA Pol II）转录本或者直接结合到RNA PollII的C末端结构域（arboxy-terminal domain，CTD)。这些因子包含RNA结合基序，比如RNA识别基序（RNA recognition motifs，RRMs)或锌指（zinc fingers ，ZnFs）以及由低复杂度的辅助结构域（low complexity,LC），包括hnRNPA1,TDP-43,FUS,MBNL。剪接因子也可以与单链RNA（single-stranded RNA,ssRNA）基序或者成型前体RNA结构（G-quadruplexes）,由此形成动态的RNA-PNP复合体在细胞核输出之前连续的通过RNA螺旋酶和蛋白与蛋白相互作用进行变构。

b）hnRNPA1, TDP‑43和FUS的LC区域突变引起RNA-RNP复合物的错误折叠导致异常剪接。

c）微卫星的扩张引起的疾病：剪接因子MBNL在重复序列中识别一个基序，由此引起重复序列的扩张，单链区域，RNA发夹形成扣留了蛋白因子最终导致功能的丧失和错误的剪接。

错误剪接疾病的治疗策略

错误剪接引起的疾病治疗策略主要介绍反义核酸和小分子方法。

a）杜氏肌营养不良症（DMD）患者中，Eteplirsen可以在超过2年的时间内安全地维持其对行走速度的有益作用，并且是首个能在这一时间段内稳定膈肌功能的药物。Eteplirsen是一种用于治疗肌萎缩蛋白外显子51缺失（产生无功能的肌萎缩蛋白）患者的药物。该药是一种电荷中性磷酰二胺吗啉代寡核苷酸（PMO），用于占13%的携带该突变的DMD患者，通过与肌萎缩蛋白pre-mRNA外显子51结合而引导肌萎缩蛋白基因的选择性剪接。缩短但仍有功能的肌萎缩蛋白（比如在贝克肌营养不良症中观察到的蛋白）的转录和翻译由此得以恢复。

b)SMA是一种运动神经元疾病，其会导致控制肌肉和随意运动的神经发生退化，这些神经元往往需要一种名为运动神经元存活（SMN）的蛋白来维持功能；正常情况下所有细胞中都会包含两种蛋白SMN1和SMN2的突变体的指令，在健康的病人中SMN1是非常充足的，而由于分子编辑的问题往往会使得SMN2出现短缺不稳定的形式。

在SMA患者中，由于产生SMN1的指令发生错误，往往会使得细胞不再产生SMN1蛋白，因此细胞就会依赖于SMN2来行使自己的功能；研究者Adrian Krainer教授表示，我们开发了一种新型药物，其可以进行正确的编辑，增加神经元细胞中功能性SMN2蛋白的水平，这种名为反义寡核苷酸（ASO）的药物分子在临床前治疗SMA小鼠模型中表现出了极大的潜力，如今研究人员正在进行SMA病人的临床III期研究。

研究者表示，ASO可以直接运输到SMA患儿的脑脊髓液中，大量研究表明SMN对于中枢神经系统非常重要，因此研究人员如今都在致力于研究如何增加中枢神经系统中全长的SMN的水平。本文研究中研究者开发了一种新方法，其仅可以在大脑周围组织中恢复SMN的产生；随后研究者利用皮下注射ASO的方式来治疗SMA模型小鼠，结合以前的研究结果，研究人员发现，ASO可以增加新生小鼠机体的中枢神经系统和周围组织中的SMN的水平，而且通过皮下注射的部分ASO还可以到达中枢神经系统来有效治疗小鼠模型的疾病。

c)ASO Gamper治疗强直性肌营养不良症：Rochester大学医学中心、Isis制药公司和Genzyme公司的科学家通过反义寡核苷酸治疗，在小鼠肌肉细胞中消除了一类有害的RNA，成功逆转了强直性肌营养不良症的症状。

强直性肌营养不良症是一类最普遍的肌营养不良症，约有35,000美国人患有强直性肌营养不良症。这种遗传疾病患者的肌肉会逐渐萎缩和僵硬，最终难以行走、吞咽和呼吸。患者的眼睛、心脏和大脑也会受到影响。尽管有药物可以改善其中一些症状，但目前没有药物能够停止这一疾病的发展。

约在十年前，科学家就发现这种疾病的基因缺陷的致病机制与其他遗传疾病存在很大的差异。在绝大多数遗传疾病中，一个基因突变意味着一个重要蛋白的合成出错，或者根本无法合成。

而强直性肌营养不良症的基因突变产生了一种在细胞核中累积的异常信使RNA，它会介入并阻碍其他蛋白起作用。其中一个受到影响的蛋白是MBNL1，该蛋白帮助构建氯离子通道，对于肌肉的电信号控制非常重要。该蛋白受到影响使肌肉发出错误的电信号从而引发强直性肌营养不良症的相关症状。

科学家根据强直性肌营养不良症的致病机制，利用体内一个负责将RNA切成片段的酶，开发了一种合成化合物。这种反义寡核苷酸药物是带有化学修饰的短片段DNA，它能与有害RNA结合，其上的化学修饰使之能成为机体RNase H酶的作用目标。

研究人员建立了1型强直性肌营养不良症DM1的小鼠模型，对其进行反义寡核苷酸药物实验。研究显示DM1致病突变产生的转录本对于反义链沉默特别敏感。反义寡核苷酸药物能快速knockdown小鼠骨骼肌中的有害RNA，成功逆转了小鼠的症状，使有害RNA的水平减少了超过80%，显著减轻了肌肉的僵硬程度，改善了肌肉的显微结构，使肌肉中的电信号回归正常。并且在治疗中断后该效果维持了1年。

研究还发现，全身性的反义寡核苷酸治疗手段，也能在肌肉中成功knockdown Malat1(在核中积累的lncRNA)。研究为反义寡核苷酸治疗提供了一个一般性的策略。

研究人员指出，该治疗药物能否对患者有效还言之过早。不过，鉴于强直性肌营养不良症的致病机制对于反义寡核苷酸治疗特别敏感，且该药物对小鼠模型中极为有效，他们对此持谨慎乐观的态度。

“研究结果显示了反义寡核苷酸治疗手段可以从根本上治愈疾病，这给我们以极大的鼓舞，这是相当重要的一步，”文章资深作者，Rochester大学医学中心的神经学家Charles Thornton博士说，他从事强直性肌营养不良症的新药开发研究已经有二十多年。

“不过，现在就断言这一治疗方法会不会在人体中也同样起作用还为之过早。在生物医学研究中就曾经出现过药物在小鼠中起作用但对人体不起作用的先例，”

这种化合药物被称为“antisense”是因为其基因序列是目标RNA链的反义链。这种反义链化合物只会精确的与强直性肌营养不良症基因的RNA结合，而不会影响其他成千上万的重要RNA。

环状RNA的起源与pre-mRNA剪接竞争

《circRNA Biogenesis Competes with Pre-mRNA Splicing》，Molecular Cell,Volume 56, Issue 1, p55–66, 2 October 2014

1. 环状RNA的产生经常与mRNA共转录

2. 环状RNA生成率主要通过内含子序列调控

3. 环状RNA生成与正式的pre-mRNA剪接相互竞争

4. muscleblind与侧翼内含子相互作用促进外显子环化

长链非编码RNA Gomafu调控精神分裂症相关的RNA剪接

《The long non-coding RNA Gomafu is acutely regulated in response to neuronal activation and involved in schizophrenia-associated alternative splicing》Molecular Psychiatry，(2013), 1–9

Gomafu是否通过与剪接因子结合而引起精神分裂症相关基因的可变剪接呢？

已有文献报道称，Gomafu能够和剪接因子SF1结合，作者猜想，Gomafu是不是通过与剪接因子结合而调控DISC1和ERBB4的可变剪接呢。为证实这个猜想，作者选用人类蛋白质组芯片，寻找能够与Gomafu结合的蛋白。

研究者对人类神经元进行刺激后，用人类蛋白质组芯片进行检测，筛选到了和Gomafu相互作用的剪接因子，包括SRSF1和QKI，其中QKI与Gomafu的结合最强。

作者用电泳迁移率检测（EMSA），也证实了QKI能够与Gomafu结合。而且，已有报道称，剪接因子QKI与精神分裂症的发病紧密相关。

图例：Gomafu直接和剪接因子QKI结合

a：QKI最可能和Gomafu相结合

b：EMSA检测表明Gomafu和QKI相互作用

Gomafu相关的可变剪接模型

结合以上的实验结果，并借鉴LncRNA&mdash;MALAT1作为脚手架结合蛋白，从而调控基因表达的模型，研究者提出一个Gomafu相关的可变剪接的模型：当神经元没被激时，Gomafu作为一个支架，结合多种剪接因子，且这个复合物限制在核中特定区域；当神经元接受刺激而激活后，Gomafu表达下调，剪接因子自由地释放，从而引起精神分裂症相关的基因的可变剪接。