circRNA的形成调控机制

1、研究背景和生物学问题

环状RNA（circRNA）是动物细胞中广泛存在的一种非编码RNA形式，分子呈封闭环状结构，不受RNA外切酶的影响，表达稳定，不易降解。已有的研究表明，circRNA的表达具有细胞特异性，这也就预示着它们在形成过程中是受到调控的，也从一定程度上说明了它们是具有特定功能的。目前，对于circRNA的研究主要围绕着两个问题：形成过程受什么调控？功能是什么？本文中，作者阐明了在EMT过程中circRNA的形成调控机制，发现了RNA结合蛋白Quaking在circRNA在形成过程中的促进作用，初步建立了circRNA的形成调控模型。

2、研究流程图

3、取材

人类乳腺上皮细胞（HMLE），间充质化的人类乳腺上皮细胞（mesHMLE）

HEK 293T细胞，MDA-MB-231细胞

4、研究技术

转录组测序，双荧光筛选技术，siRNA，shRNA，RIP

5、具体研究过程

1）在人类EMT过程中，circRNA的形成受到调节

人类乳腺上皮细胞（HMLE）在上皮间充质转变（EMT）前后， circRNA的形成受到了一定的调节。测序分析发现，在HMLE中，有5178种circRNA，而在mesHMLE中，circRNA种类显著增加到8084种，其中两者共有3417种circRNA。在EMT前后，mRNA的水平变化不大，但circRNA显著增加，经qRT-PCR验证确认mesHMLE中的许多circRNA显著升高。

图1.HMLE和mesHMLE的 circRNA种类维恩图

图2. qRT-PCR验证mesHMLE中circRNA的表达情况

2）circRNA形成过程中起重要作用的调节因子的筛选

构建得到双色荧光筛选系统—circScreen，该系统在circRNA形成时表达GFP，在线性mRNA形成时表达mCherry。利用siRNA敲降RNA结合蛋白，通过检测绿色荧光与红色荧光的比例变化，筛选得到与circRNA形成有重要联系的调控因子QKI。同时，在EMT过程中也发现QKI蛋白显著升高。

图3. A：双色荧光筛选系统；

B： siRNA敲降RNA结合蛋白后绿色荧光和红色荧光的比例变化情况；

C：Western验证mesHMLE中QKI蛋白水平

3）QKI通过结合pre-mRNA内含子上的结合位点调控circRNA的形成

在SMARCA5 pre-mRNA 上circRNA形成区域的上下游，分别存在两个潜在的结合位点，若同时突变上游或下游两个结合位点，或四个结合位点同时突变，均会极大减少circRNA的形成。所以，QKI蛋白通过结合SMARCA5 pre-mRNA 上结合位点，促进circRNA的形成。当对QKI进行敲降或过表达时，circRNA的形成发生相应的下调或上调。

图4. 1,2或3,4或1,2,3,4发生突变时绿色荧光与红色荧光比例变化情况

1,2 上游两个结合位点 3,4下游两个结合位点

4）在内含子区域特异性插入QKI结合位点，可促进circRNA的形成

作者选择四个基因SYT8, ADD3, TIMP1, 和 NACAD，该四个基因不能在HMLE, mesHMLE, MDAMB-231, 和 HEK293T中形成circRNA。构建得到包含基因三个外显子和QKI结合位点的质粒，在HEK293细胞中过表达，通过RT-PCR验证发现，在这些细胞中存在circRNA的形成。

图5. A：构建得到的质粒—基因的三个外显子和存在于内含子中的QKI结合位点；

B：qRT-PCR验证QKI和QKI结合位点存在时circRNA的形成情况

6、结论

在EMT过程中，Quaking通过结合pre-mRNA上的特定结合位点，促进circRNA的形成。随着Quaking表达量升高，circRNA的数目和表达量也随之增加。

图6. 整篇文章的主要研究过程与结果

7、参考文献

Conn S J, Pillman K A, John T, et al. The RNA Binding Protein Quaking Regulates Formation ofcircRNAs. Cell, 2015, 160(6):1125–1134.