shRNA的设计

1. Sigma网站

　　Sigma 公司做了一个针对人和小鼠的shRNA 库，而且部分基因的shRNA序列经过验证,因此直接使用Sigma 公司已验证过的RNAi 序列最为方便。

　　首先打开网址：http://www./life-science/functional-genomics-and-rnai/sirna/mission-predesigned-sirna.html，以Fli1为例，直接输入基因名，点击search，出现以下界面：

　　在Products中找到并点击shRNA选项，然后出现这个界面：

　　点击“MISSION shRNA Lentiviral Transduction Particles”这一行的PRICING，这时会弹出界面展示针对目的基因的shRNA：

　　当出现时，恭喜你，这个基因有被sigma验证过，下拉可以找到验证过的shRNA，用来构建慢病毒，简单有效，敲减效率基本上是有保证的。如果没有验证过的shRNA，则根据需要多选择几条shRNA也是一样能筛选到有效的靶点。提示：小编倾向选择CDS区的shRNA，3UTR基本不选，而且选择的每一条shRNA都会在NCBI上做BLAST，确保靶点是特异性的。Blast比对后最终确认选择下面2条FLI1基因的shRNA：

　　需要特别提醒，如果要构建到慢病毒载体上，合成出去的shRNA引物会根据载体有些不一样，sigma用的是pLKO.1载体，小编常用SBI的pGreenPuro(CMV) 载体，两端的酶切位点是BamHI/EcoRI，设计出去的引物最终是这样的（不同shRNA替换中间红色部分）：

Sense: GATCCCCCTTCTGACATCTCCTACATCTCGAGATGTAGGAGATGTCAGAAGGGTTTTTG

Anti-sense: AATTCAAAAACCCTTCTGACATCTCCTACATCTCGAGATGTAGGAGATGTCAGAAGGGG

2. Life Technologies网站

　　Life Technologies公司有个非常实用的在线shRNA设计软件，操作非常方便，而且设计出来的shRNA不再需要到NCBI上Blast，直接可以用的。

　　首先打开网站：http://rnaidesigner./rnaiexpress/，在Target Design Options处选中shRNA，以Fli1为例，输入Accession number或Nucleotide sequence，其他条件不变：

　　下拉到底点击RNAi Design，然后出现推荐的10条靶点序列：

　　根据Rank评星，选择其中需要的（翠花一般选择4条，不同位置各一条），点击Design shRNA Oligos：

　　然后在Default Loop Sequence选择合适的序列（翠花用的载体是pGreenPuro，不需要这个序列，就默认了，后面合成引物的时候要去掉的），在Custom Loop Sequence处输入CTCGAG，点击Design：