 World Meteorological Day 但凡做过基础实验的小伙伴们都知道，基因敲低（gene knockdown）和敲除（gene knockout）都是常用的基因功能研究方法，然而它们的实现方式和效果略有不同。下面小薇就跟大家科普下两种方式的区别和应用吧！ PS：SCI不会写的速进，亲测有效，欢迎大家提前预约~有需要加入科研日常讨论群的欢迎添加小薇，拉大家入群，仅限科研交流，按需添加！还有更多科研资料可免费获取！ 概念及应用 基因敲低是指在细胞或生物体中通过RNA干扰（RNAi）等方法降低目标基因表达水平，使其功能受到抑制。RNAi通常通过合成人工转录后小干扰RNA（siRNA）或利用稳定的反义RNA（shRNA）介导靶向降解mRNA来实现。由于RNAi的效果通常是部分抑制目标基因的表达，因此被称为基因敲低。基因敲低可以帮助研究者探究特定基因的生物学功能、代谢途径等，是一种常用的基因功能研究方法。 基因敲除则是通过基因组编辑技术等手段，将目标基因的DNA序列从细胞或生物体中彻底删除或失活，阻断其转录和翻译过程，使目标基因完全失去功能，同时还可获得与基因敲低不同的表型。常见的基因敲除技术包括CRISPR/Cas9系统、转录激活样效应核酸酶（TALEN）技术、锌指核酸酶（Zinc finger nuclease）技术等。基因敲除技术通常能够取得更明显的表型，对于探究基因作用、疾病机制、药物靶点等方面具有更高的研究效度。 总之，基因敲低和敲除是两种常见的基因功能研究方法，前者主要通过RNAi等方法降低目标基因表达水平，后者则通过基因组编辑技术等手段将目标基因完全失活。掌握这些技术的优缺点及适用范围，将有助于更加准确的研究相关生物学问题。 基因敲低或敲除载体 基因敲低载体： （1）siRNA载体：短小的干扰RNA序列，通过RNAi途径靶向RNA降解或保护mRNA免受翻译； （2）shRNA载体：较长的干扰RNA序列，可以形成稳定的hairpin结构，通过RNAi途径实现靶向RNA降解或保护mRNA免受翻译，有效性比siRNA更高； （3）CRISPRi载体：包含CRISPRi靶向序列和转录抑制子，通过抑制靶向基因的转录水平实现基因敲低效果。 基因敲除载体： （1）CRISPR/Cas9载体：包含Cas9核酸酶和sgRNA靶向序列，通过精确定位靶向基因DNA序列并引入双链断裂点，从而实现靶向基因的突变和敲除； （2）转录激活样效应核酸酶（TALENs）载体：与CRISPR/Cas9类似，包含特异性核酸酶和nuclease binding domain，通过切割靶向基因DNA序列实现敲除和编辑； （3）锌指核酸酶（ZFNs）载体：包含具有特异性的锌指结构域和核酸酶，通过切割靶向基因DNA序列实现敲除和编辑。 需要注意的是，以上载体都具有其特定的优点和适用范围。在选择基因敲低载体和基因敲除载体时，需要根据实验需求、细胞类型、基因结构等因素进行综合考虑。 基因敲低或敲除载体的构建方法 基因敲低载体的构建方法： （1）设计目标基因的干扰序列，通常采用在线设计工具或经验公式来计算； （2）合成干扰序列的DNA或RNA片段，克隆到转录载体中，生成siRNA或shRNA表达载体； （3）将siRNA或shRNA表达载体转化至大肠杆菌中，进行筛选鉴定； （4）提取筛选出的重组质粒，通过腺病毒、腺相关病毒等途径将其导入到目标细胞中。 基因敲除载体的构建方法： （1）设计基因敲除的靶点以及合成序列，选择CRISPR/Cas9等酶切工具对目标基因进行精确编辑，实现敲除； （2）将编辑过的靶点序列插入到特定的载体中； （3）转化编制好的敲除载体至大肠杆菌中，进行筛选鉴定，验证敲除效果； （4）最终通过病毒载体、电穿孔等方法将敲除载体导入到目标细胞中。 需要的是，不同的基因敲低和敲除方法、载体类型、组织细胞类型等都会对构建流程产生影响。同时，在实际操作过程中，也要根据实验需求和经验进行不断优化，并结合各种技术手段进行验证，确保敲除或者敲低效率和精度的准确性。  以上就是今天分享主要内容了，小伙伴们如果在基础实验中遇到任何问题，都可以私信小薇哦！ 最后请允许小薇打个广告，小薇可以提供专业的论文评估、润色、修回指导、实验设计等服务，有需求的小伙伴欢迎私信小薇~  |
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