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基本原理
本法是应用偶联剂使酶与抗体结合。即通过应用单、双或多功能基试剂,分别与大分子的抗体所存在的功能性基团发生反应,生成酶一抗体偶联复合物。不同的酶-抗体复合物制备方法中,最广泛应用的是第步加入戊二醛的方法,本法与其它偶联方法相比,具有操作简单、反应条件温和,及实用面广等长处。 试剂及仪器 亲和纯化的多克隆抗体或生物化学纯的单克隆抗体(5mg/ MI Pbs液或0.1mol/L磷酸缓冲液 用以标记的酶(EIA级,有商品供应) 辣根过氧化物酶(HRP,纯度为A430/A275>3),黑曲霉葡萄糖氧化酶,小牛肠碱性磷酸酶(AKP) 或大肠干菌β一D—一半乳糖苷酶均可选用,但以HRP最为常用 25%戊二醛液(电镜级） 0.1mol/L磷酸钾缓冲液(pH6.8) PBS(见附录） 2 mol/L甘氨酸液 蒸溜甘油 透析袋(分子量6000-8000） 电磁搅拌器和搅拌棒 操作步骤 一、抗体与过氧化物偶联 1.将5ng抗体与10ng酶在总体积1ml的0.1mol/L磷酸钾缓冲液(pH6.8)混合 2.在4℃对0.1mol/L磷酸钾缓冲液(pH6.8)透析过夜 3.用0.1mol/L磷酸钾缓冲液(pH6.8)稀释戊二醛至1% 4.透析混合液中加入50μ1稀释过的戊二醛,在室温下轻1轻搅拌三小时 5.加入2mol/L甘氨酸液使最终浓度达到0.1mol/L,混合液室温放置2小时,以封闭残存的醛基 6.混合液在4℃对PBS透析过夜 7.10000×g4℃离心30分 8.将上清移入另一管中,按体积1:1加入甘油,使终浓度达50% 9.置-20℃保存 二、抗体与ARP偶联 1.将5mng抗体与10mng酶在总体积2ml的0.1mol/L磷酸钾缓冲液(pH6.8)混合 2.其它操作同HRP标记法 三.抗体与荷萄氧化喜偶联 按HRP偶联法操作,仅加入的1%二醛改为150u1 抗体与β一D一半乳着苷豪偶联 按HRP偶联法操作,但见偶联反应总体积改为2m1,1%戊二醛用量改为的100u1 反应质量测定 可用抗原包被的微量板通过直接酶免疫试验测定偶联度。 实验要点及说明 1.如果参与偶联的氨基位于抗体和抗原的结合位点,则在偶联反应中,被标记抗体的亲和性能会不同程度的受到破坏 2.主要影响偶联成功率的原因是在反应混合液中有游离氨基存在,游离氨基容易和戊二醛反应,因而干扰蛋白质的交连。因此,必须用绝对不含有机物的水配置缓冲液,并且反应混合液要在偶联前对该缓冲液充分透析,是反应成功的要点反应不能应用Tris-甘氨酸缓冲液。 更多阅读：什么是抗体标记？ |
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