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失之毫厘，谬以千里。这句话用在百变的微生物组研究中最正确不过了。 下面结合取样、样品存储、DNA提取、文库准备、测序和分析等10个关键因素说说，如何系统和周到的在现有技术下保证16S微生物组研究中的最佳一致性？ 全文约3800字，建议阅读时间7分钟。 01 样本采集 1、采样点：不一致的采样点可能会引起微生物群落变化，比如：胃肠道、呼吸道的不同部位，不同的土壤深度等。 2、采集方法：不同样本采集方法、非侵入性／较少侵入性的方法能否替代侵入性采集方法说法不一。例如，研究显示，人肠道拭子和活检标本、呼出气冷凝液和肺刷、经口留置胃管和瘘管采样菌群差异显著；牛瘤胃的一项研究则显示，不同的采样方法差别不大；另外，鼻拭子和活检样本、直肠拭子和粪便样本菌群组成又差异不大了。缺乏共识和标准化的情况下，采集方法的一致性和预实验就十分重要了。 3、均匀度：重要的事说三遍，混匀！混匀！混匀！尤其在肠道、土壤等高复杂或大尺度采样时。 Note：参考已有／文献中数据时，首先看采样方法是否一致，尽量避免来自不同采样方法的数据的比较。同一项目的待比数据尽量保证采集条件、标准和方法的一致性。 02 样品存储 新鲜样本、直接提取时最好的选择，如果不能，最权威的做法无疑是快速冷冻到-80度。
新鲜VS冷冻样本： 两项研究表明，冷冻样本中F/B明显升高。Fouhy et al的研究显示，冷冻的影响只到属，门、纲水平群落无甚差异。DNA提取前把粪便样本冷藏个24h或72h，微生物组成和多样性都不会造成太大差异。 Lauber等在不同温度下储存土壤、粪便和皮肤样本，发现储存时间对菌群结构和多样性没有显著影响。－80 oC存储2年，群落变化很小，仅 OTU数目减少，lactobacilli and bacilli丰度略有增加。 Note：最好新鲜样本即时处理，如若不行，可以按不同保存时间等设置不同批次，处理方法、存储时间和DNA提取批次的记录很重要。 03 使用保护剂 McKain等人探讨了使用低温保护剂(即甘油/磷酸盐缓冲液)来存储瘤胃样品的效果，qPCR发现，没有使用冷冻保护剂的冷冻样品存在拟杆菌的显著损失。 Choo等人比较了使用几种常用保护剂 (即RNAlater, OMNIgene.GUT 和Tris-EDTA)和-80oC直接干燥冻存的粪便样品的菌群分布，发现OMNIgene.GUT效果最好、差异最小；Tris-EDTA处理组发现一些重要的细菌类型如Escherichia-Shigella,Citrobacter 和 Enterobacter发生了显著改变；效果最差的是RNAlater，菌群结构发生剧烈变化。 Note：选用保护剂保存样本时，十分重要的是，所有样本的处理一致（选用同一种保护剂）。 04 DNA提取 可能影响提取和下游PCR实验的原因包括： 1、某些难于裂解的微生物细胞，包括细菌内生孢子和革兰氏阳性菌等，影响提取效率。 2、抑制剂（来自环境、土壤、粪便中的残骸、有机物等）可影响下游PCR效率，常见的抑制剂主要是有机质（如腐植酸、胆汁酸盐和多糖等）和一些无机质（如钙离子）。 提取方法上，手提最经典的方法就是酚-氯仿提取法。此外，适用于各种样本类型的商用试剂盒也非常丰富，这里不多介绍。值得注意的是，很多文献都显示，不同的提取方法可能引发微生物群落的剧烈变化。 Note：所有样本的提取尽量采用一致的方法，在保证特定物种成功提取的情况下尽可能的提高产量和质量。得率的优化可以从核心步骤bead beating开始，建议预先优化整体protocol。 05 文库构建 1、区域和引物选择：基于主流测序平台，目前常见的16S rRNA测序区域选择以V4（适用于2 X 250测序）和V34（适用于2X 300测序）等为主，然而事实上，没有哪种引物是真正通用的，多项不同区域的比较研究给出了各种各样的结论。值得注意的是，针对特定关注的微生物类型，也可以选择一些特定的区域扩增。不同引物可能导致相对丰度和物种丰富度的改变，进而改变微生物群落结构。 2、PCR循环数：降低PCR循环数可以减少嵌合体的产生。 3、高保真聚合酶：不同的聚合酶对特定细菌群和整体细菌群落结构有显著影响。 4、起始DNA量：PCR反应的起始DNA总量也可能影响细菌群落结构。 Note：16S测序中并没有真正的“金标准”，重要的是选择尽量适合的引物，考虑到PCR试剂和PCR条件的优化，并在研究中保持一致。 06 测序平台 454：事实上在很长一段时间里，Roche454是文献和微生物组计划们（如HMP）最常见的选择平台，虽然有同聚物的错误，但是速度读长OK，一度独领风骚。然而通量小、成本高，逐渐退出竞争链。 illumina：目前最主流的选择，其中又以MiSeq平台更为适用。16S metabarcoding的特点决定了其对读长的要求，是以目前市场上主要服务的机型并不是大热的HiSeq X或NovaSeq，而是相对面世更早、读长更长的MiSeq(2 X 300)和HiSeq 2500 (2 X 250)。 Pacbio：Pacbio和下面的Nanopore为微生物组研究带来的希望是，无需头疼选择好的扩增区域了，超长读长使常规16SV1-V9区可以全测通，其他功能微生物的可扩增和鉴定范围也进一步拓展。Pacbio目前的配套建库、生信分析工具日趋成熟，陆续有文章证实技术的可靠性。然成本过高，在某些程度上限制了应用范围，目前已在逐渐降低成本。 Nanopore：号称使长至天际的测序仪，读长优势也很明朗。但是错误率偏高，新技术文章积累不足，实验、测序到信息分析的普及程度仍需发展。
计划开展16S测序（注意只是测序）时，需要考虑4个关键因素： 1、数据质量 2、测序成本 3、测序读长 4、每个run可以测序的样本数量 Note:应根据实验目标、错误率、测序覆盖率和样本数量的关系等选择合适的测序平台。例如，主要研究群落中的核心物种，那么就可以通过增加样本数量来降低一个run中每个样本的覆盖率进而降低成本，如果稀有物种则反之。 07 模拟细菌群落 1、Mock Communities：已知比例的预混合细菌群落是一个很好的量化误差的方法。模拟群落可以从美国标准菌库（ATCC）或Zymo Research获得。 2、Spike-in standards：在每个样本中添加标准物，以在单样本基础上进行质量控制。为防止与样本序列存在交叉，此处要选择不太可能出现在感兴趣样本中的细菌，或者in silico设计的和数据库中有差异的序列。 Note：推荐！ 08 分析策略 流程和分解步骤的分析软件和数据库，在之前的文章中做过详细解释和点评,👉👉9个模块＋40余款软件＋老司机辣评 | 16S信息分析流程软件和数据库合集。 这里补充一项，基因拷贝数校正： 不同的细菌类型16S rRNA基因拷贝数有所不同，想要准确获知真实的拷贝数信息比较难。 但是，目前已经有一些工具，可以利用序列数据库和系统遗传信息来校正拷贝数变化。其中包括Copyrighter、rrNDB、picanteR包和pplace中的函数，以及功能预测工具PICRUSt也包含有拷贝数校正的功能。 然而，既然是基于数据库，那么，考虑到数据库中的信息数量，仍然是不够全面的。 09 污染问题 DNA提取试剂盒、PCR试剂和实验室环境中产生的微生物DNA污染在研究低微生物量样品时可能会造成非常严重的影响。 1、阴性对照（或仅仅只有试剂）可以比较好的发现问题。 2、处理之前的随机抽样可能有助于减少此类问题发生。 具体的解决污染的方法： 1、去除PCR试剂背景污染物的扩增：Primer-extension PCR(对其他来源污染没有影响) 2、去除试剂和实验室环境中的DNA污染：紫外线和γ辐射、酶处理、硅基膜过滤、CsCl2密度梯度离心法、漂白剂/CoPA溶液处理等。 Note：想要开展靠谱的16S研究，建议包含reagent-only controls（例如，DNA提取试剂盒和PCR控制）。 10 模拟细菌群落 1、Mock Communities：已知比例的预混合细菌群落是一个很好的量化误差的方法。模拟群落可以从美国标准菌库（ATCC）或Zymo Research获得。 2、Spike-in standards：在每个样本中添加标准物，以在单样本基础上进行质量控制。为防止与样本序列存在交叉，此处要选择不太可能出现在感兴趣样本中的细菌，或者in silico设计的和数据库中有差异的序列。 Note：推荐！ 马上要做16S测序了，来划个重点吧： 记录并保存好所有实验中的原始数据 研究方法不同时，比较需谨慎。 尽可能从新鲜样本中提取DNA，或在相同的时间内用同样的方法保存样本。 采用beat beating DNA提取方法可让细胞裂解更充分。 参考文献选择适合的引物（注意：通用引物往往不通用！） 对完全重叠的reads去冗余，使研究结果更接近真实微生物群落。 在测序的每一个run里设置模拟微生物群落。 在每个run中做一个只有试剂的阴性对照，进一步避免潜在误差。 除此之外，最重要的是，良好的是实验设计，以及从样品制备一直到后期分析的方法一致性。
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