助力2019国自然基因申请——微生物多样性测序解决的科研问题

微生物多样性测序介绍

16S rRNA基因存在于所有细菌的基因组中，是细菌编码rRNA相对应的DNA序列，其高度的保守性和特异性是细菌进化的“分子尺标”。16S rDNA测序是指对样品中的16S rRNA基因高变区进行PCR扩增及高通量测序的一种技术，广泛应用于微生物群落的快速鉴定。

在真核生物rDNA中，转录间隔区ITS在进化过程中承受的自然选择压力小，能容忍更多的突变，在绝大多数的真核生物中表现出极为广泛的序列多态性，选择ITS进行高通量测序，有利于区分不同的真菌。

微生物多样性测序流程

① 基因组DNA抽提和质检

依据不同样本类型，使用相应的试剂盒进行抽提，（不同样本类型试剂盒使用建议：微生物样本取样方法和注意事项）。DNA提取后，使用Thermo NanoDrop 2000紫外微量分光光度计和1%琼脂糖凝胶电泳进行总DNA质检。

DNA样本送样要求：

DNA样品总量：单次建库的量m≥250ng，建议送2次建库的量，m≥500ng；

DNA样品浓度：c≥5ng/μL，浓度以Qubit质检结果为准；

DNA样品纯度：260/280在1.8-2.0之间；

DNA样品完整性：DNA无降解，即电泳有明显的主带。

注：若老师自行提取并邮寄DNA样本，请尽量提供纯化好的DNA及DNA质检结果（电泳胶图或Qubit/Nanodrop定量结果）。

② 引物设计并合成

细菌16S rDNA扩增选择区域为V3-V4区，使用的通用引物为341F和806R（详细内容，请阅读《16S测序及区域选择小科普》）；真菌扩增选择区域为ITS2区，使用的通用引物为ITS3和ITS4。在通用引物的5’端加上适合Illumina PE250测序的index序列和接头序列，完成特异性引物的设计。

参考文献：

[1] Conservative Fragments in Bacterial 16S rRNA Genes and Primer Design for 16S Ribosomal DNA Amplicons in Metagenomic Studies. [J] PLOS One, 2009.

[2] ITS as an environmental DNA barcode for fungi: an in silico approach reveals potential PCR biases. [J] BMC Microbiology, 2010.

③ PCR扩增和产物纯化

以稀释后的基因组DNA为模板，使用高保真酶进行PCR，确保扩增的准确性、特异性和高效性。用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并用凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物。

图1 16S rDNA PCR反应示意图

图2 ITS2 PCR反应示意图

④ PCR产物定量和均一化

文库质检合格后，使用Qubit进行文库定量，并根据每个样品的数据量要求，进行相应比例的混合。

⑤ Illumina测序

使用Illumina PE250进行上机测序。

图3 16S测序原理图 (ITS流程图类似)

拟解决的科学问题

基于二代高通量测序技术，对细菌（16S）或真菌（ITS）的可变区序列进行测序，研究样品中微生物的种类，获得样品中微生物的群落组成和相对丰度，探讨微生物群落与环境之间的关系。

① 物种组成分析

一般以柱状图的形式展示各个样本或各组样本在不同物种分类水平上优势物种的相对丰度。文章中的描述一般是某水平上优势物种是什么，其相对丰度是多少，例如门水平的优势物种分别是厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门……此外还可以根据菌群的属性进行描述，如有害菌和有益菌的相对丰度是多少。

图4 各样本属水平上优势物种

相对丰度组成柱状图

图5 不同分组属水平上优势物种

相对丰度组成柱状图

② 物种多样性分析

Alpha多样性分析：Alpha多样性包括物种组成种类和均匀度。在数据分析或文章中有两个用处：

（1）用于评判测序深度是否可以覆盖该样本中的物种组成情况，多出现在早期高通量测序文章中；

（2）比较不同分组中物种多样性的差异。一般情况下，健康组中的微生物多样性高于疾病组，可能是疾病组中的一些致病菌的丰度增加，对其它的菌群有一定的抑制作用。此外也有一些疾病类型是疾病组的微生物多样性高于健康组，如阴道类型的疾病、帕金森疾病等。详细内容，请阅读《学好物种多样性分析，要从Alpha多样性抓起！》！

图6 各样本Alpha多样性chao1指数稀释曲线图

图7 A组和B组shannon指数差异分析

Beta多样性分析：用于比较不同分组间微生物群体整体组成是否有差异，是一个量化的数值，其值的大小反映每个组内各个样本间微生物群落组成的差异，其中Unifrac算法是基于物种之间进化距离计算，考虑物种的丰度为weighted，不考虑物种丰度为unweighted。（备注图9~图12均可以采用weighted和unweighted进行分析）。详细内容，请阅读《微生物β多样性，组间比较的利器》！

图8 各样本间物种组成差异分析

图9 组间差异与组内差异比较Anosim分析

图10 PCA分析

图11 PCoA分析

③ 差异物种分析

差异物种分析描述某些物种在不同分组中的富集情况，例如与对照组比较，某些在疾病中显著富集的菌群是条件致病菌，与研究的客观情况相符合。差异物种分析的方法主要有：秩和检验、STAMP分析和LEfSe分析。其中秩和检验和STAMP分析显示某特定水平上物种的差异，LEfSe分析可以全面的显示各个水平上物种组成的差异。详细内容，请阅读《差异微生物/基因在哪里？四款分析方法来相助》！

图12 差异物种LEfSe分析

图13 差异物种STAMP分析

④ 功能预测

为了能够通过16S测序数据来准确的预测出功能构成，首先需要对原始16S测序数据的种属数量进行标准化；然后将16S的种属构成信息通过构建好的已测序基因组的种属功能基因构成表映射获得预测的功能结果；再基于功能预测的结果进行差异分析或相关性分析等。详细内容，请阅读《16S/ITS功能预测 | PICRUSt等5款软件带你上车》和《差异物种与代谢通路关联分析》！

⑤ 相关性分析

物种与物种之间相关性分析，用来描述物种之间的互作关系。一般情况下健康人的微生物互作关系较强，疾病状态可能因为菌群紊乱，某些致病菌丰度增加，导致了微生物的互作关系减弱。物种与环境因子之间的相关性分析或物种与代谢通路间的相关性分析等有助于更好的揭示某种现象，解释某种机制。详细内容，请阅读《跟着Spearman进入相关性分析世界》和《MaAsLin | 教你分析微生物丰度相关性》！

图14 差异物种之间的互作分析

图15 差异物种与代谢通路的相关性分析

图16 物种与环境因子之间的RDA分析

图17 物种对代谢通路的贡献分析

⑥ 个性化分析

结合特定的研究内容会开展一些个性化的分析，以增加分析亮点，如研究疾病与菌群的分析，基于一些算法挑选疾病的微生物标记物，用标记物做疾病诊断模型，对临床研究有重要意义；研究婴儿菌群组成的影响因素，会测定环境、母亲生殖道、母亲皮肤等微生物的组成，做溯源分析，研究婴儿菌群组成的污染比例。

图18 疾病诊断模型构建

图19 溯源分析

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温

馨

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示

在《微生物样本取样方法和注意事项》中，我们已详细向您介绍了样本取样建议和注意事项，建议您取样时采取“少量多管”的方法。送样时，请完整填写纸质版《样品信息单》！样品寄送戳这“如何打包寄送测序样品才安全？”。

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供稿：卢彦姣

编辑：鲁淑妮