基本原理
胶体金在光镜和电镜中均为有效的标记物,可以检测单一和多重抗原。胶体金在电解质中不稳定,但被蛋白质包被的胶体金是稳定的。一般常用免疫球蛋白或蛋白A包被胶体金,可作标记二抗进行免疫检测,本方法应用范围广,染色后的样品可以长期保存
试剂和设备
超速离心机
显微镜
温箱
分光光度计
0.2um微孔滤膜
载玻片,盖薄片,滤纸
氯金酸钠
1%柠檬酸钠水溶液
山羊抗鼠Ig抗体
对T淋巴细胞特异的鼠抗人单克隆抗体
自人外周血分离的白细胞悬液
10%氯化钠
1%聚乙二醇
0.01mol/LpH7.2的PBS
1%戊二醛乙醇溶液
50%硝酸银溶液(提前一天配制)
明胶显影液,2g明胶溶解于99ml蒸馏水中,加1ml甲酸
操作步骤
(一)胶体金溶液制备
1.称取0.1g氯金酸钠,溶解于LL去离子水中
2.加热煮沸,剧烈搅拌下,迅速加入25m新配的1%柠檬酸钠溶液
3.继续煮沸5分钟,至溶液变成桔红色
4.用蒸馏水将溶液的525nm波长下的光密度吸收值调到0.8
（二）胶体金的包被
1.将山羊抗鼠Ig抗体以36900×g离心30分钟:
2.上清液经0.2nm滤膜过滤
3.确定蛋白质包被的最佳浓度:将蛋白质作连续10倍稀释各lml,加入5ml胶体金溶液,1分钟后加入lml10%氯化钠溶液,静止5分钟:以胶体金溶液为空白对照测定光吸收度,选择最低吸收值的蛋白质浓度用于正式包被。
4.取50ml胶体金溶液,用02MK2CO3调pH值为7.6,按照确定的最佳比例将蛋白质加入并快速混合让蛋白质吸附2分钟后,加0.5ml1%聚乙二醇,防止非特异性凝集，000Xg离心1小时,弃上清液,将胶体金悬浮于含1%聚乙二醇的PBS中
6.弃去上清液,将包被的胶体金溶液用5m含1%BSA的PBS稀释,经微孔滤膜过滤后,4℃保存
(三)抗原检测
1.取20ul人外周血白细胞与5ulT淋巴细胞特异的单克隆抗体在4℃下孵育30分钟
2.1000r/分离心清洗细胞5分钟,2次
3.将洗涤后的细胞与20u1(一般效价1:20)胶体金标记的山羊抗鼠Ig抗体在室温下孵育30-60分钟
4.1000r/分离心清洗细胞5分钟,2次
5.将细胞涂片于载玻片,用1%戊二醛固定细胞10分钟,清洗多余固
6.将载玻片细胞面向上置于放有湿润滤纸的培养皿中,加4滴50%硝酸银溶液和2滴明胶显色液,覆以盖玻片,放入60-65℃的温箱中,显色3-4分钟,直至玻片标本呈现金褐色为止
7.移出盖玻片,用蒸馏水迅速漂洗数秒,晾干;
8.光学显微镜下观察
对照试验
可以用未加一抗的细胞作为对照试验组
试验要点及说明
1.所使用的器皿均应非常洁净,需经过硅烷化处理
2.使用高纯度多次蒸馏去离子水
3.胶体金颗粒的形成、大小和速度,均决定胶体溶液的稳定性,水质和玻璃表面对启动还原和稳定胶体十分重要,本过程制备的胶体金颗粒直径约为18-20nm
4.因为胶体金在电解质中不稳定,本实验全部操作过程要严格、迅速,注意液体颜色
5.蛋白质包被胶体金时的相对最佳浓度要事先测定,测定最佳浓度时,胶体金溶液的pH值也要调节到pH76
6.一抗和胶体金标记二抗的稀释浓度应事先经预试验以最佳效价
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