 古语云：“没有规矩，不成方圆”；但有了规矩，做出来的就一定是方和圆吗？再明白一点说，也许我们以为的方或圆，其实是个三角形。 de novo T790M，就是我说的那个“三角形”。 为天地立心，为生民立命，为往圣继绝学，为万世开太平 先来简单说说我们通常理解的故事：在NSCLC的靶向治疗历程中，IPASS研究有着“为天地立心”的重要意义，它第一次把“EGFR基因突变”这个标准创新性的引入了肺癌的治疗领域，把原先以化疗为主的治疗模式撕开了一条大口子，让靶向治疗的理念照进了肺癌治疗的现实。随着治疗模式的深入，药物研发的进展，更多的临床需求不断浮出水面。 在“为生民立命”的过程中，越来越多的研究结果发现，大多数的EGFRm 的患者，在使用一段时间的一代TKI(吉非替尼、厄罗替尼)之后，一般是8-11个月左右，都会出现不同程度的进展。分析其原因可知，一代TKI耐药后，50-60%的患者会出现20号外显子T790M突变，这个是大家都知道的事情了，于是，“为往圣继绝学”的信念催生出了所谓“三代TKI”----奥希替尼。 研发者披肝沥胆，通过AURA, AURA2, AURA3这一系列研究，终于证据确凿的证明了在一代TKI耐药的患者中，如果通过标本检测出T790M突变，继续应用奥希替尼，又可获得近10个月的PFS（无进展生存时间），如此美好的结果，人们欢呼雀跃，奔走相告。与此同时，人们在思考：既然奥希替尼也同样作用于EGFR，而且在AURA研究中，也有一线应用的模式（相关文章已于最近发表于JCO），可否尝试直接将其应用于一线，一劳永逸的“为万世开太平”？FLAURA研究应运而生，直接将奥希替尼和一代TKI进行头对头比较，而且目前得到的PFS的结果也是令人欣慰的（PFS:18.9月vs10.2月）。 请注意，我之所以只用了“欣慰”，而没有用“鼓舞”，“振奋”，“激动”等词语来描述FLAURA研究，是因为在很大程度上，人们对于奥希替尼有着很高的期盼。不考虑统计学逻辑的胡乱算法：如果AURA3的10个月的PFS，加上IPASS的10个月，就至少是20个月，FLAURA的实验组如果能达到这个数值，人们也许就没有那么多的顾虑了，可它偏偏就是18.9个月，你愿，或者不愿意，数据就在那里，不多不少的尴尬着。 奥希替尼目前获批的适应症是： 适用于既往经表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(TKI)治疗时或治疗后出现疾病进展，并且经检测确认存在EGFR T790M突变阳性的局部晚期或转移性非小细胞性肺癌(NSCLC)成人患者的治疗。 刚才说了，20个月的PFS心理预期是不符合客观规律的，有些一厢情愿。所以，我们还是需要进行基于数据和生物学本质的分析。这个时候，“原发”和“继发”耐药的说法，就不可避免的进入我们的视野了，“de novo”的字眼也开始越来越多的见诸于文献之中。 基于目前的临床应用分析， 原发性T790M的突变，很可能从一开始就影响了奥希替尼在一线应用时的疗效，而文献报道的发生率则在2%-80%不等。这跨度是不是有点大？是的，原因有很多，目前认为和标本类型，处理方法，检测技术的敏感度等均有关系，但似乎从来没有人对于 de novo 的真正含义提出过异议。 其实，原发和继发的这两种耐药模式，我们并不陌生。早在抗生素开始广泛应用的时代，人们就了解，没有一个侠客是可以持久的横行于江湖的。在肿瘤治疗领域，化疗的耐药机制更是早为人们所熟知。而关于de novo，我们先来看以下几段文字，均来自于2016-2017年以来的文献： 1、Similar to drug resistance associated with chemotherapy, resistance to EGFR TKIs includes intrinsic (primary) and acquired (secondary) resistance. Intrinsic resistance is generally defined as a de novo inactivation of EGFR TKIs, whereas acquired resistance is generally defined as relapse of the disease following a period of clinical response.（Oncotarget） 2、Historically, drivers for drug resistance have been suspected and found on the genetic level, with mutations either being pre-existing in a subset of cancer cells or emerging de novo to mediate drug resistance.（Journal of cell communication and signalling） 3、Pre-existing intratumoral heterogeneity has been shown to influence treatment response and the development of acquired resistance to targeted therapy in some contexts34, but there has been little direct clinical evidence to 三篇文章从用法到含义，对于de novo的理解都是不一样的。第一段话明确指出：固有耐药，原发耐药，de novo三者是一个含义；而第二段和第三段中的de novo被当作副词和定语，分别修饰emerge 和 evolution，是相对于Pre-existing所说的，而第三段话更是明确的说出，de novo的进化是“继发性耐药”的主要机制。矛盾，显而易见。 哦？那么问题来了：de novo 到底是什么意思呢？如果是原发的意思，那么后两者如何解释？它和Pre-existing是一样的吗？如果理解为继发， 我们从文献中所获取的关于de novo的信息是否经过仔细的甄别？如果没有，这是否是导致原发性T790M发生率差异巨大的原因之一？ 请原谅小V的咬文嚼字，因为它确实困扰了我好久，特别是在最近，不把它弄清楚，我寝食难安。 先来看看de novo原本的意思。维基百科是这样写的： De novo mutation, an alteration in a gene that is present for the first time in one family member as a result of a mutation in a germ cell (egg or sperm) of one of the parents or in the fertilized egg itself. 我来试着解释一下：变异方式主要分三种：遗传变异、de novo突变，体细胞突变。 先说de novo突变：de novo来自拉丁语，意为“重新，更始”。家族中首次出现，意味着父母没有，突变在精子和卵子形成受精卵的过程中产生，是一种胚系突变。因此，一般来讲身体的各种器官和组织都会携带这种突变。 与其相对的叫做遗传变异，来源于父母，写作 inherited。多数孟德尔遗传病的致病基因是遗传自父母的。有想法的你也许会问：那父母的这个突变是哪里来的呢？Good！当然是遗传自父母的父母~ 第一代也有可能父母的de novo突变。也就是说，de novo突变是可以遗传的，因为他是一种胚系突变。 最后一种体细胞突变就比较好理解了，是在受精卵之后，身体的一种或几种组织或器官中的细胞所发生的突变，如肿瘤细胞中的突变，是不能遗传至下一代的。 因此，按照维基的解释，de novo就是原发性突变，亲代没有（区别于遗传突变），但可以遗传至子代（区别于体细胞突变），和Pre-existing mutation 是一个意思。但是，请注意！（敲！黑！板！）这只是维基的解释，下面来看看de novo作为继发性突变来解释的证据。 这篇发表于2016年初《Nature medicine》的文章以NSCLC TKI获得性耐药患者中的EGFR T790M为例，对耐药克隆的形成（进化）路径展开探索。通过对来源于耐药患者肿瘤细胞的培养，证实了上述的两种假说，耐药的克隆有两种来源：
研究人员将含有EGFR突变的NSCLC- PC9细胞在逐渐升高的易瑞沙环境中培养，直至出现明显的耐药性并经确认都携带有T790M突变，分别是PC9-GR2和PC9-GR3。虽然都携带T790M, 两个细胞系有诸多不同之处：
上述PC9-GR2和PC9-GR3在不同时间出现的克隆预示着：两者产生的机理也许是不同的。 研究人员对50个早期耐药克隆的Allele-specific quantitative PCR分析显示，这些克隆确实含有EGFR T790M突变。在培养的条件下，这些克隆对Gefitinib 耐受，但对WZ4002敏感。进一步采用基于NGS技术的ClonTracer方法，结果证实：在Gefitinib的治疗过程中，这些早期出现的EGFR T790M耐药克隆确实来源于肿瘤内本身就存在的EGFR T790M细胞。换言之，对于肿瘤而言，一代TKI的治疗，在某种层面上，可以看作达尔文进化过程中的一种选择压力，将Pre-exsiting的突变细胞筛选了出来。 之后，研究人员对来源于亚克隆A的14个pool（每个pool含有5,000个细胞）在Gefitinib条件下培养40周，其中8个pool的细胞为EGFR T790M阳性，剩余的6个为阴性。证实了：在EGFR抑制剂治疗过程中，EGFR T790M突变也可de novo地从原先对TKI治疗耐药的阴性细胞中进化而来。经过累积密度函数（cumulative density function, CDF）计算，晚期耐药EGFR T790M阳性克隆来自本身存在EGFR T790M细胞的可能性仅为0.006，基本不可能。 有句话，你一定听过： 你信不信我不知道，反正肿瘤不仅相信，还这么做了。 在文章中晚期继发耐药的部分，作者多次提到了de novo 这个字眼，均是用来形容自发进化的意思。 根据定义，TKI耐受细胞意味着不会由于药物的作用而引发细胞凋亡。从晚期耐药的这类细胞对于治疗的凋亡水平来看，类似于PC9-GR3细胞，来源于TKI耐受细胞的晚期EGFR T790M耐药克隆在WZ4002的作用下表现出低水平的凋亡。同样情况下，早期耐药克隆则表现出明显的细胞凋亡。 之后，文章对于另外一个来源：MGH119的两个晚期突变耐药克隆进行分析，MGH119-GR1和MGH119-GR2在WZ4002情况下，也表现出低水平的凋亡。结果表明：与早期EGFR T790M突变耐药克隆不同，来源于TKI耐受细胞的晚期突变克隆在EGFR抑制剂（WZ4002）条件下仅处于低细胞凋亡水平。 在随后对患者的TTP（Time-to-progression）进行分析后显示，低细胞凋亡水平克隆对应的患者在临床上表现为更长的TTP。也就是说，从细胞水平看，对于一代TKI耐药较晚出现的克隆，会表现出较长的TTP，相比来说，早期出现耐药的细胞株对于三代TKI的反应更明显，但TTP较短，这是否也能在动物试验中得到重复验证目前不得而知，如果可以，也许就能从机制上解释FLAURA研究的PFS没有达到人们预期，或许部分原因在于：奥希替尼治疗组的人群中在早期即出现对于一代TKI耐药患者的比例可能较高，因此对于奥希替尼的反应性会较好，但却无法转化为PFS。当然，这只是一种猜测，需要进一步证实。但临床应用中确实存在奥希替尼在一代TKI耐药后的T790M阳性患者中应用，部分患者出现了快速进展的情况，而这些出现快速进展的患者之前的用药模式，基于上述结果，是很有必要进行分析的。 按照文章的逻辑，T790M的模式是这样的：要么一直存在（pre-exsiting），要么治疗过程中产生，这个产生的过程，叫做 de novo。 当然，还有很多其他的耐药模式。 之前有报导指出，即使在未经TKI治疗的患者样品中能够检测到EGFR T790M突变，但并不能排除样品制备和测序过程中人为误差而产生的假阳性（譬如福尔马林溶液的浸泡，以及各种不同灵敏度的检测方法）。上诉研究证实：在肿瘤组织中确实存在着丰度极低的EGFR T790M突变细胞，进化上早期EGFR T790M突变耐药克隆来源于这些细胞，第三代EGFR-TKI对这些细胞能诱发细胞凋亡，但这类细胞的比例是多少，文章没有描述，一般认为在2%-5%之间。 说了这么多，似乎也没有把de novo的含义解释清楚，不管怎样，哪怕只是提出一个问题，希望大家关注就好，再遇到de novo字眼的时候，建议可以明确一下具体应用的环境，毕竟在基础研究领域和临床实际应用中，de novo的含义是有差别的。但无论de novo的意思是什么，非小细胞肺癌在TKI治疗过程中EGFR T790M突变耐药克隆不同进化路径的机理研究，对于患者的治疗方案选择都具有非常现实意义，值得深入探讨。 |
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