1、腺相关病毒载体是不是只要能转入细胞就可以整合到宿主细胞基因组中?如果不是,那么整合率大概有多少?是不是跟靶细胞类型有关呢? 野生型AAV病毒感染细胞后倾向于整合到19号染色体的AAVS1位点。这个特性是与其rep基因功能和ITR结构以及染色体特定位置的序列相关的. AAV载体是经过改造的,已经去除了其repcap基因,因此已经失去了特异整合的特性。 对于不同的靶细胞,AAV载体的整合几率是不同的。越来越多的研究发现,在许多组织中AAV载体进入细胞后并不整合,而以附加子(episome)形式存在,最为典型的是在肌肉中。 也有些研究报道AAV载体的整合是相对随机的,有整合到活跃的基因中的倾向。
2、据说AAV在细胞上的表达远比不上在动物体内的表达,为什么? AAV载体在体外实验中用于转导培养细胞时,常发现其表达水平较低,而且有表达延迟现象。这是因为AAV基因组是单链的,它进入细胞以后,必须要有一个由单链变为双链的过程,然后其所携带的外源基因才能进行转录和翻译,在没有辅助病毒或其它辅助因子的情况下,这种AAV由单链DNA在细胞内复制形成双链DNA的过程是十分缓慢的,因此相对于其它双链DNA病毒载体如单纯疱疹病毒(HSV)和腺病毒(Ad),其表达明显延后。此外,AAV对细胞毒性低,培养的细胞在加入AAV后,细胞分裂生长能力不受太大的影响,这样也对AAV载体有一种稀释作用,也导致其表观表达水平较低。而在体内应用时,注射部位的组织细胞通常没有显著增殖,不会出现AAV载体被稀释的情况,而且在体内各种促进AAV载体所携带外源基因表达的各种因子相对丰富,故体内应用时,AAV载体的表达水平比较高。 研究表明辅助病毒或其它辅助因子可以明显促进单链DNA复制成双链DNA,从而明显提高外源基因的表达水平,故在体外应用可以考虑加入辅助病毒(Ad5)或丁酸钠(终浓度10~50mmol/L),这样可以提高表达水平达5~10倍。
3、我的试验需要多少总量的AAV病毒? |
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