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前不久，药明健康大会上进行个有意思的讨论：医药界的下一个颠覆在哪里？有几个嘉宾都提到基因编辑会是下一个产生颠覆的技术，基因疗法将会有所突破。 从去年开始，基因疗法的资本领域持续升温，新基90亿美元收购Juno，赛诺菲116亿美元收购Bioverativ，诺华87亿美元收购AveXis，罗氏43亿美元收购Spark；百健8亿美元并购Nightstar。 前FDA局长Scott Gottlieb近期也发表声明，目前FDA已经累计接收了超过800份细胞或基因疗法的IND申请。预计到2020年，每年将接收超过200份IND申请。预计到2025年，FDA每年将会批准10-20个细胞和基因疗法产品。 种种迹象表明，基因疗法临界燃点了，要火啊！小伙伴们四处奔走相告，都要上车？急啥啊，笔者的基因疗法干货篇得认真读完啊。 笔者既不打算追溯到1963年，从Joshua Lederberg第一次提出了基因交换和基因优化的理念开始说起，也不打算跟大伙瞎聊CRISPR技术晦涩的作用原理，笔者只想帮大家理清基因疗法的种类、如今的临床进展和笔者的一些思考（因为笔者也只是基因疗法小白）。 开篇前提示一下：本篇写的基因疗法是泛指，不仅仅是利用CRISPR技术对特定DNA片段的敲除和加入，也包含利用病毒载体转入基因疗法（包含CAR-T和溶瘤病毒）、小核酸类药物的疗法，但不囊括小分子作用RNA领域或作用表观遗传学的部分，如下图所示。 一、基因疗法的分类：傻傻分不清楚？ siRNA？microRNA? ASOs? mRNA？RNAa? CRISPR?这都是啥啥啥？都认识，那shRNA和piRNA还认识吗？（认全的可以私下加我，同样是九年义务教育，你简直太优秀了！） 看不懂吧？来，听我说（chui）。 ※ “缺啥补啥”的mRNA和基因转入 ★ mRNA又叫信使RNA（Messenger RNA），是通过DNA转录而来，携带遗传信息，能指导蛋白质合成。那么mRNA疗法又是啥呢？举个栗子：甲基丙二酸血症/酸尿（MMA）是一种破坏性的代谢性疾病，发病机制是由甲基丙酰辅酶A变位酶（MUT）完全（mut0）或部分（mut）缺乏所导致，大白话就是体内没酶了，咋办呢？补酶呗！那咱吃酶行吗？光吃，也不吸收啊，没法给咱干活了。那就补点mRNA,让它指导翻译，多合成点酶，这样就齐活了。近期的生物板块最大IPO公司BioNTech和Moderna Therapeutics就是干这事的。而基因转入疗法的设计原则也类似，区别是病毒载体上装载的是cDNA基因，需要经过转录和翻译才能生产指定的蛋白质，比mRNA疗法多了一环节。 ※ 基因沉默的“三剑客”—siRNA、ASOs、miRNA ★ siRNA又称小干扰RNA（Small interfering RNA），通常是一段长21个核苷酸的双股RNA（dsRNA，非内源，人工合成），作用是与之互补的目标mRNA进行沉默（降解）。那siRNA疗法是个啥呢？举个例子：hATTR多发性神经病患者是指遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性（hATTR）引起的周围神经疾病。通俗的讲，患者是由于异常形式TTR过多而导致，那么我们如何减少这些异常TTR形成呢？拿塞子堵住行不行呢？那当然不行了，我们只需要用给患者体内注入siRNA（Alnylam 公司开发的Onpattro）来沉默TTR的RNA即可，这样就可以减少周围神经中淀粉样沉积物的积累。 ★ ASOs: 反义寡核苷酸(Antisense oligonucleotides), 是指与靶基因mRNA互补的一段单链DNA或RNA序列，通常由十几到几十个碱基组成通过化学合成的方式生产。其作用机制是也是导致靶mRNA降解或抑制靶mRNA的翻译。ASOs疗法原理其实跟siRNA一样，都是沉默目标mRNA，使得致病蛋白表达水平降低，从而达到治疗的效果。 ★ miRNA（microRNA）:是一种小的内源性非编码是一种大小约21-23个碱基的单链小分子RNA, 通过与靶基因mRNA的配对，促进mRNA的降解或抑制其翻译，作用跟ASOs类似。那什么是miRNA疗法呢？比如，mir-103/107基因在肥胖小鼠模型及NASH患者的肝脏中表达量明显上调，研究者用RG-125，（一种N-乙酰半乳糖胺修饰的反miR 103/107 低聚核苷酸）通过解除miR 103/107对相关mRNA的抑制，即可治疗糖尿病或者NASH了。 ※ 基因激活的“一枝花”—RNAa ★ RNAa：RNA激活（RNA activation），由靶向特定的基因启动子DNA区域的双链小RNA（dsRNA）分子介导。这类针对基因非编码区的dsRNA被称为agRNA（antigene RNA）, 其中能诱导RNAa现象（激活基因表达）的agRNA被称为small activating RNA （saRNA）。RNA激活疗法，顾名思义就是通过基因转录水平激活内源性基因表达来实现治疗疾病的目的，比如通过RNAa激活人体内抑癌基因，从而达到抑癌的效果。 上面提了这么多的小核酸药物，就不能不问，全国核酸哪家强，还得看我大昆山。顺便植入一则小广告，想产业落户的，项目咨询的都欢迎来撩。 ※ “神奇剪刀手”—CRISPR ★ CRISPR：（成簇的规律间隔的短回文重复序列，Clustered regularly interspaced short palindromic repeats），是一种基因编辑技术，在向导RNA（guide RNA， gRNA）和Cas9蛋白的共同作用下，细胞目标基因组DNA可以被精确剪切。随后生物体自身存在着DNA损伤修复的应答机制，非同源末端连接（NHEJ）修复模式：会将断裂上下游两端的序列连接起来，从而实现了细胞中目标基因的敲除；同源定向修复（HDR）模式：如果在此基础上为细胞引入一个修复的模板质粒（供体DNA分子），这样细胞就会按照提供的模板在修复过程中引入片段插入，这样就可以实现基因的替换和插入。 以上的基因疗法分类主要是从技术原理来划分，当然基因疗法也可以从产生作用的方式来划分，比如： 1) 体外基因编辑或转入：治疗原理是体内的某些功能细胞因为基因突变导致功能丧失，把这些丧失功能的细胞取出来，进行基因编辑或者基因导入，使它们获得正常的细胞功能，再回输到病人体内，即可完成治疗。比如：β-地中海贫血属于常染色体隐性遗传病，其编码β-珠蛋白的基因异常使β珠蛋白的合成减少或不能合成，α-珠蛋白大量积累，导致血红蛋白的组分改变，进而引发红细胞寿命缩短。β-地中海贫血的离体 (Ex Vivo)基因治疗过程主要包括：先收集病人的造血干细胞；再使用BB305将正常的β-珠蛋白基因导入其中，使细胞功能恢复正常；最后将改造后的造血干细胞回输给病人。另外，目前火热的CAR-T也是类似的治疗思路。 2) 体内生效：体内基因转入或者递送。对于一些基因突变导致的功能蛋白减少，或者异常蛋白增多，我们可以采用病毒载体（AAV）或者非病毒载体（脂质体或）将mRNA、siRNA、ASOs、miRNA的抑制剂、或者是正常基因递送到相关细胞中，采用这类的载体携带的基因通常不整合到基因组中，目的基因会稀释，因此需要长期给药。比如2016年批准的Spinraza，2017年批准的LUXTURNA等。 3) 体内编辑：主要是CRISPR技术，基因编辑技术可以对目标基因进行删除、矫正和添加。比如：张锋的Editas Medicine公司，EDIT-101将编码Cas9的基因和两个指导RNA（gRNA ）装载进AAV5病毒载体。通过视网膜下注射直接注射到患者感光细胞附近，将基因编辑系统递送到感光细胞中。当感光细胞表达基因编辑系统时，gRNA指导的基因编辑可以消除或逆转CEP290基因上致病的IVS26突变，从而改善感光细胞功能，为Leber先天性黑朦10型患者患者带来临床益处。 二、基因疗法的研发进展 1、基因疗法临床数量有几何？ 根据 The journal of gene medicine的统计数据，截止到2019年之前，基因疗法的临床试验高达2930例，主要还是分布在I期和II期中。这里需要注意的是同样的项目可以开几个临床试验，也可以针对很多适应症，因此实际的基因疗法项目其实没有2千多个。各试验分布阶段如下： 2、基因疗法治疗哪些适应症？ 目前的基因疗法临床试验还是仍以肿瘤为主占66.6%（包括CAR-T和溶瘤病毒），其次是单基因遗传病11.5%，感染疾病6.3%，心血管疾病6.2%，神经系统1.8%等。笔者认为，基因疗法目前在遗传基因缺陷、神经系统和眼科疾病取得了突破性成就。一方面得益于病因的生理学基础，另一方面得益于基因疗法递送系统的创新。各试验适应症统计比例如下： 3、基因疗法使用哪些载体？ 其实狭义讲的基因疗法， FDA直到2017年才批准第一个。困扰基因疗法前进最大的问题就是载体递送系统。载体系统需要安全性、免疫原性、转染效率、组织靶向等几大方面的考量。目前基因疗法使用的载体分两大种（当然也有不需要载体的），一种是病毒载体；另一种是非病毒载体。 A、病毒载体 常用的是逆转录病毒、慢病毒这两种病毒属于整合型病毒，可以将携带的基因插入到宿主细胞的基因组中，具有感染效率高、感染细胞广、但同时也存在病毒毒性、免疫原性、基因插入突变等许多问题。 另一种病毒载体常用的是腺相关病毒（AAV），它是属于非整合型病毒，不改变宿主细胞的基因组，因此不存在基因插入突变的相关问题。同时AAV还具有一个非常独特的优势，它通常具有组织靶向性： 目前科学家已经发现了十几种腺相关病毒亚型，不同亚型的病毒对不同组织细胞有不同的亲和性，从而部分解决了病毒载体组织细胞靶向性的问题。例如，最常用的血清 2型腺相关病毒（AAV2）对骨骼肌细胞、神经元、细胞平滑肌细胞和肝细胞具有高亲和性。但AAV病毒也有两个主要的缺陷，可携带的目的基因片段较小： 逆转录病毒携带目的基因的容量通常在 8Kb 左右，而腺相关病毒仅为 4.5Kb；此外目的基因易被稀释： 腺相关病毒基因组以游离 DNA 的形式存在于宿主细胞，并不插入宿主基因组中，因此在宿主细胞发生分裂增殖时，病毒载体导入的“补偿基因”并不会随着宿主 DNA的复制而复制。当宿主细胞分裂成两个子细胞后，目的基因的数量也会被稀释，最终逐渐丢失，故而腺相关病毒在感染长期存活的非分裂细胞或分裂次数较少的细胞时优势较为明显。 基因疗法常见的病毒载体参数介绍对比如下： B、非病毒载体（主要包括裸露DNA、脂质体、纳米载体等） ★ 脂质体：脂质纳米粒（LNP）导入技术。 ★ 多肽纳米材料（圣诺的技术）。 ★ 聚乙烯亚胺（PEI）。 ★ GalNAc（N-乙酰-D-半乳糖胺）的化学修饰，肝靶向效果很好，而且不必静脉注射、皮下给药即可。 ★ 流式电穿孔技术： 2018年11月，MaxCyte授权Kite非独家使用流式电穿孔技术（flow electroporation），这一无需使用病毒转染的细胞工程技术的首次协议。 4、国内外基因疗法上市的有哪些？ 截止到目前，主流药物市场反义核苷酸共上市8个，基因转入（4），siRNA（1），溶瘤病毒（2），CAR-T（2）。从狭义上定义的基因疗法，全球首个基因药物其实是来自中国的“今又生”，是不是很惊喜，很意外？
★ 1998年FDA批准了第一个反义核苷酸药物Fomivirsen，用于AIDS 病人并发的 CMV 视网膜炎的二线治疗药物。 ★ 2003年中国CFDA批准了第一个基因治疗药物，重组人p53腺病毒注射液“今又生”。 ★ 2004年中国CFDA批准了首个溶瘤病毒“安柯瑞”，用于治疗头颈癌。 ★ 2012年欧盟批准了首个基因转入药物Glybera，用于治疗脂蛋白酶缺乏症。 ★ 2015年FDA批准了首个溶瘤病毒药物Imlygic，用于治疗黑色素瘤。 ★ 2017年FDA批准了首个CAR-T疗法，Kymriah，用于 治疗血液瘤。 ★ 2018年FDA批准了首个siRNA疗法Patisiran，用于治疗遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性。 已上市的基因疗法统计如下：
截止目前，ASOs、siRNA,基因转入、溶瘤病毒、CAR-T都已经有上市的药物，而RNAa、microRNA、mRNA、基因编辑都还在临床试验中，仍还奔赴上市的路上。
三、基因疗法—热投资下的“冷思考”？ 由基因缺陷引起的疾病多达7000余种，这些亟待我们去解决，同时基因疗法也在不断的扩展新的疾病领域。从癌症、到神经系统疾病、多种罕见病，基因疗法频频传出捷讯。资本也蜂拥而至，纷纷抢占高地。但越是在热闹的时候，进行冷静的思考，才有助于我们更加清醒的认清事物发展规律，把握未来发展方向。 ★ 一次性治愈的的基因编辑技术将会颠覆未来吗？ 相对于多种小核酸药物或者基因导入方法，大多还是需要长期的接受治疗，暂缓病情，还未到终身治愈的效果。以治疗hATTR为例的两个基因疗法，反义RNA （Tegsedi）vs RNAi（Onpattro）为例，疗效和安全数据方面，Onpattro比Tegsedi都更胜一筹。但Onpattro仍需要每三周静脉注射一次。目前来看siRNA疗法可能要优于ASOs疗法，那会不会被未来的一次性治愈的基因编辑技术所颠覆呢？ ★ 基因疗法究竟可以让多少人收益？ 目前很多基因疗法使用的是AAV病毒载体，但这只能让一小部分人获益，比如普通人中对这项试验中使用的AAV5载体具有免疫力的比例可能高达50%。对于其它类型的AAV，这一数值可能更高，比如AAV1和AAV2的免疫力可能出现在70%的人群中。那么如何让这部分人获益呢，如何开发出效率更加高的非病毒载体呢？ ★ 何时才能做到对靶组织的精准递送？ 目前GalNAc系统可以很好的靶向肝脏组织，但前的LNP系统更多的依赖于“自然”靶向过程，如靶向肝细胞的ApoE依赖的内吞途径、或纳米粒子对免疫细胞的天然靶向，而不是利用配体靶向。肝脏外的其它组织中如何发挥siRNA、mRNA、及DNA的作用的问题还需要更多的创新技术。当然我们目前也无法在指定组织中达到足够数量的基因修改。 ★ 基因疗法究竟能治疗哪些疾病？ 目前基因疗法中逆转录病毒携带目的基因的容量通常在 8Kb 左右，而腺相关病毒仅为 4.5Kb，这种载量对于一些单基因或许还管用。低挂的果实，何时会被开拓者们抢完？未来要面对多基因疾病，甚至是病因不明的疾病，该如何去设计？ ★ 基因编辑技术（CRISPR）究竟安不安全？ 基因编辑技术还存在众多的不确定性：CRISPR技术是否存在大面积脱靶效应？P53介导的修复增加导致致癌风险？Cas9的免疫风险？这些问题尚未揭开谜团。 ★ 天价的基因疗法谁来买单？ Glybera的价格约为100万美元，自2012年上市后只销售出1份。由于缺乏市场需求，于2017年黯然退市。Strimvelis的价格约为70万美元，2016年5月上市后只销售出2份，而预定接受治疗的患者也只有2个。美国强大的商业医保尚且不堪其重，那么中国呢？基因疗法治在中国治疗罕见病市场究竟会有几人能够买单？ 毫无疑问，基因疗法领域现在正处于一个振奋人心的时代，对生命源代码的改造是人类历史上的里程碑。在很多疾病领域，基因疗法就是个奇迹。在这个基因疗法的新时代，人类似乎第一次可以这么牢牢掌握自己的生命，追逐从根本上治疗癌症和罕见遗传病的方法。除了高昂的治疗费用之外，我们仍有太多相关的技术需要突破，蜂拥而至的资本会加速创新的革新，但似乎仍有一段未知的路要走。笔者对基因疗法或许有些执念，抱有一些不切实际的幻想，希望未来的治疗都可以通过基因疗法一次性治愈。（无意看到一篇文章的一段话，抄送给大家）： 一段包裹于载体中的基因 一群改过的细胞 一次或几次的注射 足以改变人类健康的面貌 甚至可能引发深刻的社会变革 然而我们坚信 这正是未来药物和治疗的模样 参考文献： [1] Wang D, Tai P W L, Gao G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery[J]. Nature Reviews Drug Discovery, 2019: 1. [2] Setten R L, Rossi J J, Han S. The current state and future directions of RNAi-based therapeutics[J]. Nature Reviews Drug Discovery, 2019: 1. [3]华金证券：基因治疗：医学革命正在到来（上篇·技术） （完） |
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