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本文转载自“态昌基因”，己获授权。 最近人体共生微生物，尤其是肠道菌群，简直火的不要不要的，经常是CNS的坐上客。各位老板有没有心动啊~ 菌群（特别是肠道菌群）的群落组成和功能的变化，与各种疾病息息相关，如动脉粥样硬化，代谢性疾病、结肠直肠癌等。虽然菌群的变化是疾病发生的原因还是结果仍未可知，但是菌群依然有很大的潜力作为疾病诊断和风险评估的生物标记物，在疾病疾病诊断和风险评估上仍然具有很高的价值。 那么怎样开始菌群的研究呢？ 当然是从看小昌写的公众号开始 Nature review 的这篇文章给了大家提供了很好的菌群研究方面的建议，从实验设计到平台选择到菌群分析。而小昌也结合实际操作中可能会遇到的问题对这篇文章的内容做了更加详细的补充。希望能对大家有帮助。 划重点 2. 样本的采集 3. 样本的保存与保护剂 4. DNA提取 5.我到底应该选择多样性测序还是宏基因组测序？ 6.测序区域选择 7.测序平台的选择 1样本选择 菌群研究的核心思想就是寻找样本间差异。样本间菌群的差异主要体现在微生物的群落结构变化和基因功能变化。这些差异可能是实验前后过程中微生物群落结构的差异（纵向比较），也可能是在不同的临床表型中微生物群落结构的差异（横向比较）。 纵向比较的研究主要为干预前后菌群变化的对比。比如说，想验证某种疾病的治疗效果，可以比较治疗前后（如药物治疗、膳食调理、生理干预）菌群的差异。横向比较举个例子来说就是比较正常人与病人间菌群的差异。 为了保证疾病与菌群的变化间具有相关性，我们需要尽可能地排除疾病以外其它因素的干扰。所以在进行样本选择过程中需要记录一些可能会干扰菌群组成的背景因素，如BMI、年龄、怀孕、血糖等。在选取对照组的时候，尽量保证组间背景因素的一致性，最大程度地保证实验结果的可靠性。 除此之外，抗生素对人体共生微生物有极大的影响。所以在选取临床样本的时候，尽量选取6个月之内未使用过抗生素的病人样本。 只有毛色差异的两只猫 Note: 背景因素的记录尽可能地全面。小昌只是提到了部分通用的背景因素，具体情况还是需要结合文献以及临床经验具体分析 2样本的采集 肠道菌群分析通常用的是粪便样本。粪便中含有大量的肠道微生物，为肠道微生物的研究提供了很好的样本。 样本的采集方法我们之前写过。大家可以点击这里回顾一下。包括人粪便、老鼠粪便、口腔各部位、皮肤及鼻腔样本的采集方法。 采样时，尽量保证样本的采样点一致，均匀性（混匀），并且要注意污染问题。 小昌这里也有粪便样本采集套装，亲测好用，需要的可以留言。 Note:若需要与已有文献中的数据相对比，尽量保证采样方法的一致性，尽量避免来自不同采样方法的数据的比较。 同一项目的待比数据尽量保证采集条件、标准、方法、采集人员的一致性。 3样本的保存与保护剂 新鲜的样本是测序分析最好的选择，可以最大限度地呈现微生物的组成和多样性信息。如果不能使用新鲜样本，采集的样本应尽快置于–80 °C冰箱中进行保存。 样本尽量保证时间上的一致性。如若不行，可按不同保存时间等设置不同批次，并记录采集时间、采样方法、存储时间等信息。 那么，如果受试者是在家取样，或取样后24小时内无法放到–80°C冰箱中应该怎么办？没关系，勤劳的生产部小哥哥已经帮你们研发了粪便样本保护剂，能保证在30天之内粪便内的菌群组成不发生太大变化。 有图有真相↓↓↓↓↓ 有保护剂的粪便样本采集方法可以点这里直接观看视频。想要保护剂可以在公众号中留言，我们会挑个最帅的小哥哥飞奔着送过去的 4DNA提取 从样品中提取DNA是一个技术活。DNA必须要保证足够的数量、高质量，并且要是样本中微生物群落的忠实表现。其实这是比较难做到的，因为在样本中会有一些难于裂解的微生物细胞，并且会有抑制剂、人的脱落细胞，以及食物残渣等等，这些都会对DNA的提取结果造成干扰。 所以，如果不是技术非常成熟，小昌还是不建议自己提取DNA的。 下面又是一个广告时间 态昌基因采用物化结合的DNA精细抽提，可以有效抽提各个样本DNA, 避免不同试剂盒的方法误差。专业的事情就交给专业的人吧。 5我到底应该选择多样性测序还是宏基因组测序？ 首先我们先看一下两者的区别。 多样性测序分析只专注于某一个特定基因，可以较为简便地获取物种信息，适用于物种丰度的横向比较。并且由于测序成本较低，我们可以花更少的费用获得更多的样本信息。但是多样性测序存在着一些其弊端，比如对物种的分辨率较低（有时候不能将微生物确定到种的水平）、无法获得真实的基因、功能、代谢信息。尽管如此，多样性测序对人体微生态的初步研究是一个强有力的工具，可以用最少的成本，尽可能多地获取微生物多样性和组成信息。 宏基因组分析不仅可以获得样本中微生物的物种信息，还可以获得微生物的基因、功能、代谢信息。物种信息方面，由于宏基因组可获得环境微生物基因信息总和，所以其对物种的分辨率也较16S多样性高，物种信息更加可靠。但是宏基因组的费用较高。
用一句通俗易懂的话就是：宏基因组哪哪儿都好，就是贵。多样性虽然存在着一些弊端，但是便宜啊。 所以，我们应该怎么选择呢？ 这要从实验目的上来看。如果实验目的只是为了比较菌群中的物种信息，多样性就够了。如果还想比较基因、功能、代谢信息，那就需要测宏基因组了。 小昌建议，实验一开始可以先从多样性做起，如果实验结果很不错，就可以考虑一下宏基因组了。 当然，土豪请随意，并且无情地砸单过来吧！
6测序区域选择 多样性测序究竟测的是什么？ 细菌多样性测序最常用的是对16S rRNA基因可变区进行测序分析。16S有9个可变区（V1-V9），可以根据不同的样本情况选择不同的可变区。对人体肠道微生物而言，一般会选用V3-V4区进行测序。
真核生物多样性测序主要用的基因为ITS或者18S 基因可变区15。 宏基因组测序可以对样本内微生物的全部基因或者绝大部分基因测序。 7测序平台的选择 在选择平台的时候，要考虑数据量和读长两方面的因素。 最好的结果就是数据量也大，读长也长，价格还低。But, 想的美。 现在的技术还达不到这么完美的结局，所以只能根据自己所需要的进行取舍。 所以进行平台间的选择时应该考虑的因素为以下几点：
下面是几个平台的比较
对于16S多样性测序而言，由于16S相对于全基因组而言是很短的，所以运行的数据量不需要太大，但是平台的读长尽可能长，这样所得到的数据结果会比较完整可靠。 Illumina MiSeq平台的读长是2*300bp, 相对于Hiseq平台而言更长，并且读长刚好可以满足16S V3-V4区（约464bp）的测序。 有人问，不是还有个Roche 454平台的嘛，那不是更多吗？ 是的，454平台的确可以测的更长，可是它贵很多啊！！！测一个454样品可以测好几个Miseq样品了。更何况，454平台已经下架了，所以，土豪们想测也没机会了。 对于宏基因组而言，MiSeq平台的通量太小，已经不适合了。Hiseq 2500和HiSeq X Ten的读长差不多，但是HiSeq X Ten的价格较低，果断选。 这么干的货怎么能不吊吊你们的胃口。 期待下一期吧
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