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★冲锋献阵★ 概 述 在过去的5年里，直接口服抗凝剂(DOAC)治疗引进临床，对临床实验室有着重大的影响。临床医生希望测定血浆中药物的存在或检测药物浓度，且较新的观察有关于DOAC的凝血检测的局限性和实用性，建议应该对早期发表的关于实验室检测的指南进行再评价了。而且这些最初的指南，通常是基于体外血浆添加药物的研究而不是接受 DOAC 治疗的患者的标本。研究证明，不论是基于体外血浆添加药物的研究的标本还是口服药物的标本进行检测，试剂灵敏度有显著的变化。浓缩药物（drug-enriched）样本数据必须慎重解释或仅作为一个指标。我们现在的实验室检测，可以用来确定药物存在和检测药物浓度，并提供推荐的实验数据（testing algorithms）。由于 DOAC 治疗也许对专业的凝血检验有特殊的影响，我们回顾这些测试可能存在的假阳性和假阴性的结果。 关键词：阿哌沙班；直接Xa抑制剂；直接凝血酶抑制剂；依度沙班；利伐沙班；治疗药物监测。 介 绍 达比加群，口服直接凝血酶抑制剂，在2010年被批准用于非瓣膜房颤患者预防中风。随后口服直接激活因子X抑制剂，特别是利伐沙班，阿哌沙班，现在的依度沙班已经获得批准用于广泛的血栓栓塞治疗和预防。使用新型抗凝血药的患者数量正在迅速增加。 临床实验室难以跟上并提供及时和准确的关于直接口服抗凝血剂(DOACs)及其对血凝实验的影响的信息。口服抗凝药的患者实验室检测的早期指南是根据当时发表物提供的可用信息。一些指南已经被修改，以反映目前用于调整DOAC 治疗的血凝实验的局限性和实用性。早期的指南，源于药品处方单和已经建立好的止血结构的指南，建议有实用性的全球筛选实验，如凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血酶原时间(APTT)，评估 DOAC 抗凝。 虽然这些指导方针一致表示谨慎看待它们的使用并且描述筛选实验的局限性，这些早期公布的数据主要是基于添加药物（drug-enrichd）混合正常健康成人的血浆，或是合并没有试剂和仪器详细信息的临床实验数据。那些添加药物正常血浆研究，并提供详细的试剂和仪器的资料，但是这些试剂和仪器并不普遍采用在日常实验中，限制它们为临床实验室提供帮助。而且多数指南建议每个实验室应了解本实验室的针对DOAC的试剂灵敏度，在缺乏专业知识的实验室，这些信息仍然是难以捉摸的。随着越来越多的患者接受DOAC治疗，早期关于 DOAC 和凝血实验的指南，虽然在当时有最佳证据，但是现在来说已经明显的不成熟。我们发现显著差异在试剂灵敏度上，当比较凝固时间，添加 DOAC 血浆样本、接受 DOACS 的患者的标本和商业药物定标品(表 1- 3)]。 虽然添加药物的正常血浆的应用提供了有价值的信息，关于DOAC对规定试剂系统的敏感性，与药物影响其他的凝血实验一样(例如因子水平和蛋白 S)、正常的血浆体外添加药物的凝固时间不能反映DOAC治疗的患者的标本的结果，所以只作为指导。 图表（1）Recombiplastin 2 g(R2GPT；仪器实验室)凝血酶原时间 PT 对利伐沙班敏感性的比较评估，患者标本，商业校准品（Hyphen），添加药物的正常病人血浆（NPP）。 图表（2）Actin FSL 活化部分凝血酶原时间 (APTT) (SiemensHealthcare Diagnostics，Newark， DE， USA)试剂对利伐沙班敏感性的比较评估，患者标本，商业校准品（Hyhen），添加药物正常患者血浆（NPP）。 图表（3）Actin FSL 活化部分凝血酶原时间 (APTT) (SiemensHealthcare Diagnostics，Newark， DE， USA)试剂对达比加群敏感性的比较评估，患者标本，商业校准品（Hyhen），添加药物正常患者血浆（NPP）。 临床实验室专家应该带头研究 DOACs 凝血实验的影响，因为他们通常拥有最多的关于检测方法和仪器的专业知识。临床实验室专家还应该主动与临床医生确定什么信息是临床需要的，对于DOACs推荐适当的实验，并帮助解释结果。临床医生对于DOACS患者最常见的问题包括：(i)药物是否存在；(ii)有多少存在?实验室解决这些问题，是实验室的复杂性和检测的功能性决定的。每个实验室应该有实验数据（testing algorithms）来解决这两个问题。虽然每个实验室都定量DOACs是不可能的，但提供一些药物水平的评估，在紧急情况下也是有帮助的。本文的目的是描述实验室实验在评估DOAC抗凝上的应用。测量或监控 DOAC抗凝效果超出了本文的范围，力不能及。 临床问题：DOAC的存在？ 有两种可能的情况，DOAC的存在有着非常重要的临床意义。第一种情况，已知患者DOAC用药史，需要紧急的干预和治疗(e.g 中风或局部麻醉)。 第二种情况，未知用药和治疗史的患者需要紧急药物治疗。在治疗创伤或者中风的治疗中心，后者情况更突出一些，但是，也许任何提供重的或紧急的治疗的机构也许评估不能提供用药史（如创伤和中风）的患者（例如旅行者）。除了HPLC 和LC-MS/MS以外，所有目前可用实验快速评估 DOAC 的实验都缺乏特异性，因此实验室结果必须结合临床表现。 文献研究表明，通过筛选演算法（PT 和 APTT）识别 DOACS 的存在的必要性，而且已经广泛的用于达比加群而不是 FXa DOAC。我们增加对 DOAC 治疗的患者研究，表明正常 PT 和 APTT 测试结果可能不排除存大量的抗活化的 FII(FIIa)或 anti-FXa DOACs，尤其是阿哌沙班的患者。有充分的数据表明正常凝血酶时间检测(但不是稀释凝血酶时间(DTT))对于接受达比加群治疗的患者是一个高度敏感的方法，用于排除药物存在。因此，无论已知的或未知的用药史的患者检测，传统的凝血酶时间(TT)检测应该被纳入实验室检测计算达比加群存在的一部分。因为检测下限和最低检测限(LOQ)的限制，校准的dTT可能不能充分判定剩余药物的数量，在药物被认为是假性缺乏的情况时(如组织类型纤溶酶原激活物治疗急性中风或局部麻醉)。最近的出版物也提出了一个担心关于制造商提供的低达比加群校准物的不准确可能导致低估药物存在或数量。 PT 试剂对药物浓度的敏感性取决于特定的DOAC，这个问题正在讨论中。临床医生必须明白，一种试剂报告对 anti-FXa DOACs 有高敏感性(例如 e.g. Neoplastine [CI PlusDiagnostica-Stago Corporation ， Parsippany ， NJ ， USA)or Recombinplastin 2G[Instrumentation Laboratory， Bedford， MA， USA])，这种试剂仅依赖于个别 anti-DOAC而不是对所有药物都有相同的敏感性(图 4)。出版物报道肝素校准的 anti-FXa 检测可作为来一个高度敏感的方法来确定药物的存在(或缺乏)(图 5)。其他定量或评估患者的药物浓度的方法被描述为用于已知的 DOAC 用药史的患者使用，包括稀释蝰蛇的毒液时间(DRVVT)纠正 PT，point-of-care methods，发色 anti-FXa，凝血酶生成化验和血栓形成，但都对 DOACs 缺乏特异性，这限制了它们作为筛选或定量的方法使用。尿方法检测达比加群和利伐沙班的代谢产物，有价值的替代血液检测，但是这些方法并不与血液中药物的浓度相关，因此应该谨慎解释结果。实验室和临床医生的解释数据必须结合病史和表症，评估指症的一致性与(如接受 DOAC 治疗，但有其他原因的凝血病)。以下几点关于评估的 DOACS 存在。 图表 4 PT 对利伐沙班敏感性 A 不同 PT 试剂随利伐沙班浓度增高的敏感性 B Recombiplastin 2G PT 试剂检测对不同 Anti-FXa DOAC 的敏感性 图表 5 肝素抗 FXa 和抗 FXa DOAC，低分子肝素（A）抗-FXa 和普通肝素抗 FXa（B）与阿哌沙班浓度的相关性，高区结果（Rotachrome UFH; Diagnostica Stago）是根据定标品上限决定。 已知达比加群治疗 如果患者明确应用达比加群治疗，一个普通的传统的 TT 几乎排除药物的存在。 (ⅰ) 如果 TT 升高，TT 混合等研究，TT 与硫酸鱼精蛋白、纤维蛋白原或蛇毒凝血酶实验，可以帮助区分纤维蛋白异常和达比加群效应。 (ⅱ) 如果 TT 混合试验不能纠正，那么达比加群更有可能存在。 (ⅲ) 硫酸鱼精蛋白 TT 纠正实验表明肝素的存在。 (iv) 异常 TT，正常的纤维蛋白原和蛇毒凝血酶表明达比加群的存在。 (v) 异常 TT、纤维蛋白原和蛇毒凝血酶表明低纤维蛋白原血症，hypodysfibrinogenemia 或血纤维蛋白原异常。 已知 anti-FXa DOAC治疗 如果患者明确知道 FXa DOAC 治疗，使用一个发光 anti-FXa 检测(普通肝素和低分子量肝素(LMWH)校准)检测值在或低于最低检测限几乎排除了anti-FXa DOAC 的存在。 未知用药史 如果患者未知用药史，传统的TT和使用肝素校准的anti-FXa检测可以指导临床医生anti-FIIa或 anti-FXa DOACs的存在。 (i) 正常的 TT 排除达比加群的存在。 (ii) Anti-FXa 低于最低检测限可能排除 FXa DOAC 的存在 注意:使用这些数据与 PT、APTT 和纤维蛋白原联合评估其它原因造成的出血病人的凝血障碍。 注意:发光 anti-FXa 分析化验不能区别肝素与 anti-FXa DOACs。 注意:使用尿测试可能是有用的，虽然尿液存在与血浆浓度没有相关性。 在多数没有用药史的临床情况下，应该考虑使用足够灵敏的方法来检测低水平的DOACs。有足够的证据表明，常规筛查，如 PT 和 APTT 检测 DOAC 治疗的患者标本不能完全是这些的情况。大多数自动血凝仪器，包括台式分析仪，可以检测 TT 和发光anti-FXa 检测。anti-FXa 检测的广泛使用已经被约束，因为:(i)试剂的稳定性有限，无论是上机还是复融(2)试剂的成本与 PT、APTT 和 TT 检测相比较。anti-FXa 检测对DOAC的灵敏度可通过商用校准物质评估。连续稀释度的校准物在未用药的正常血浆也许有助于确定的anti-FXa DOAC 的最低检测限。尽管利伐沙班和阿哌沙班在肝素定标的 anti-FXa 实验中反应显示类似的药物浓度相关的线性反应，我们注意到，依度沙班反应稍微低点。注意，校准物质可能不适合评估 DOAC 的 PT 和 APTT 筛查的敏感性。 临床问题:DOAC 存在多少? 如果确定病人已接受一种DOAC治疗，血浆定量或血清药物浓度可能是需要的。对于出血患者，紧急手术，创伤，肾功能不全，或药物的依赖性，等等这些情况，检测药物浓度是有临床价值的。一项研究表明检测达比加群水平，来追踪透析的药物的清除率，随后使用这些数据来估计所需的透析周期的次数，来减少的药物浓度到达安全干预水平。需要的循环时间可能直接指向检测方法，作为金标准方法分析药物过程（质谱分析法)是不可能在大多数临床实验室操作的，因为仪器和方法的复杂性。药物浓度检测先于拮抗药应用，因为他们应用还不明确。临床实验确定这些药物的用药剂量，不受循环药物浓度的影响。定量DOACs 对于调整高药物水平的患者的拮抗剂有任何优势并不明确。为了评估病人的依从性或非紧急处置，参照测试可能会成本效率更高一些，虽然收到测试结果的时间可能需要几天。 药物定量的注意事项将包括定时收集样本(低谷和高峰)，随机样本收集，报告格式，和结果解释。预期的药物浓度低谷和峰值是基于规定的剂量和频率(表 1)，但治疗的持续时间也可能影响测量药物浓度。没有共识认为低值是否优于峰值。药物低值显示最低药物浓度，而峰值样本收集可能方便一些，特别是如果 DOAC 随餐食用。随机的样本 DOAC水平往往难以确定意义，是不可靠的。然而，随机样本收集在紧急情况下往往是不可避免的。 表（1）固定剂量多种抗凝剂的 5-95 百分值
达比加群存在多少? 虽然 APTT对于达比加群相对敏感(相对于 PT)，这个检验不应被用来量化或估计药物浓度。许多药物定标方法被称为快速定量达比加群的方法包括DTT、ecarin-based方法和磷脂含量DRVVT。更具体的方法包括高效液相色谱法 HPLC和 LC-MS/MS。传统 TTs对达比加群特别敏感，因此，除用于延长凝固时间进行的方法修改(即改变凝血酶浓度或稀释样品)以外，是不用于量化药物研究的。DTT、DRVVT和 LC-MS/MS相关性好，这些方法将适用于量化达比加群。 多少 anti-FXa DOAC存在? 当前的文献的基础上，定量达比加群： 1、APTT、PT不应该用来定量或估计药物浓度。 2、传统 TT对于定量药物浓度太敏感，并只能用于检测药物的存在与否。 3、达比加群定量 DTT或 ecarin-based检测快速分析法(<10分钟)，具备良好的相关性与lc-ms s。存在狼疮抗凝剂或因子缺乏时(除了降低纤维蛋白原对="" dtt)亦不会对这些方法造成假阳性。注意:每个实验室都应该评估他们的方法的="" loq的准确性，并报告结果“小于”数字值="" loq(ng/ml)。注意:使用这些数据与=""> 4、低特异的方法，如 DRVVT或稀释凝血酶原测定，用商用校准物质，快速化验(< 10分钟)，展示了良好的相关性与=""> 5、高效液相色谱法和 LC-MS/MS非常敏感，非常具体的方法，检测达比加群低限的检测，可以考虑不需要紧急结果的患者。 虽然 PT可能相对敏感(相对，APTT)anti-FXa DOACs，这个测试不应被用来定量或估计药物浓度。有限数量的药物定标的方法，描述了快速定量 anti-FXa DOACs，包括药物定标发光anti-FXa(通常用于肝素水平测定)和磷脂含量高 DRVVT。更具体的方法包括高效液相色谱法和 LC-MS/MS。药物定标 anti-FXa和高磷脂 DRVVT与 LC-MS/MS具备良好的相关性，这表明这些方法适合 FXa DOAC定量。当前文学的基础上定量 anti-FXaDOACs:1. APTT、PT不应该被用来定量或评估 anti-FXa DOAC浓度。2.发光 anti-FXa方法用商用校准材料，快速化验(< 10分钟)，展示了良好的相关性与="" lc-ms/ms。注意:使用这些数据与=""> OACS对特殊凝血检验的影响 DOAC 用作 FXa 或 FIIa 的抑制剂，因此这些药物影响依赖于这些因子中的任一种的基于凝固法和发色底物法测定（表 2）。 这些包括许多专业凝血测定。 基于 ELISA 的测定和分子测定不受 DOAC 干扰。 因子分析 DOACs 可能增高 APTT 和/或 PT、APTT 或 PT 依赖的因子活性测定结果可能会假性降低。药物作用通常可以，但不普遍，被稀释，因此 DOACS 可能导致不平行的凝固法因子分析方法。正常血浆混合研究不完全纠正，符合抑制剂的存在，特殊因子抑制剂化验得出错误的阳性结果。FVIII、FIX 和 FX 发光分析是基于 FXa 活性的发光检测，如果一个 anti-FXa DOAC存在，会给出一个假性低的结果。 遗传性和获得性血栓形成倾向 DOACs 可能导致狼疮抗凝试验假阳性结果，在 APTT-based 和 dRVVT-based 筛选和验证性能分析。基于凝固法检测（Clot-based）的蛋白质 C 蛋白 S 和活化蛋白 C 抵抗实验，在DOACs 的存在下，可能会过高，产生不正常的结果。发色的抗凝血酶活性测定是基于发光测定 FXa 或 FIIa 激活，在 DOACS 存在下，可高估活性。真正缺乏或异常有可能掩盖了，它在停止 DOAC 疗法后，因此谨慎的考虑，在终止 DOAC 治疗之后重新检测或考虑分子检测。 结 论 1、抗-FIIa和抗-FXa DOAC同时使用时，APTT和 PT测定效用有限。 2、正常的 TT可排除使用达比加群，达比加群校准的 dTT（稀释凝血酶凝固时间）或 ecarin（血浆蝰蛇毒时间测定）方法可以用于药物浓度测定。 3、可以使用显色抗-FXa测定法检测包括 DOAC的抗 FXa抗凝药，并且药物浓度校准方法可用于测量血浆药物浓度。 4、反映抗 FIIa或抗 FXa DOAC的存在或浓度的检测数据，应该由实验室分析整理，并提供给临床医生做参考。 5、测量 DOAC的实验室必须继续监测试验性能随时间的变化，用以保证报告结果的准确性。 6、使用筛选试验和报告药物浓度必须结合患者临床病史，以及样品收集最后一次 DOAC用药的时间。 参考文献：Gosselin RC1， Adcock DM2.The laboratory's 2015 perspective on direct oral anticoagulant testing. J Thromb Haemost. 2016 May;14(5):886-93. 水彩配图：子陌 编辑推送：大树
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