RNA

差异分析的步骤：
1）比对；
2） read count计算；
3） read count的归一化；

4）差异表达分析；

背景知识：
1）比对：
普通比对： BWA，SOAP
开大GAP比对：Tophat（Bowtie2）；
2） Read count(多重比对的问题）：
丢弃
平均分配
利用Unique region估计并重新分配
表达量计算的本质
目标基因表达量相对参照系表达量的数值。
参照的本质：
（ 1）假设样本间参照的信号值应该是相同的；
（ 2）将样本间参照的观测值校正到同一水平；
（ 3）从参照的数值，校正并推算出其他观测量的值。 

例如：Qpcr:目标基因表达量（循环数）相对看家基因表达量（循环数）；RNA-seq:目标基因的表达量（测序reads数），相对样本RNA总表达量（总测序量的reads数），这是最常用的标准。
归一化的原因及处理原则：
1）基因长度
2）测序量
3）样本特异性（例如，细胞mRNA总量，污染等）前两者使用普通的RPKM算法就可以良好解决，关键是第三个问题，涉及到不同的算法处理。 

RNA-Seq归一化算法的意义：
基因表达量归一化：在高通量测序过程中，样品间在数据总量、基因长度、基因数目、高表达基因分布甚至同一个基因的不同转录本分布上存在差别。因此不能直接比较表达量，必须将数据进行归一化处理。 

RNA-seq差异表达分析的一般原则
1）不同样品的基因总表达量相似
2）上调差异表达与下调差异表达整体数量相似（上下调差异平衡）
3）在两组样品中不受处理效应影响的基因， 表达量应该是相近的（差异不显著）。
4）看家基因可作为表达量评价依据（ 待定） 

不同的算法比较：
以什么数值来衡量表达量：RPKM、FPKM、TPM
以什么作为参照标准：TMM（edgeR软件）、De seq矫正
RPKM：是Reads Per Kilobase per Million mapped reads的缩写，代表每百万reads中来自于某基因每千碱基长度的reads数。

本质：
1）以reads数为计算单位；
2）对基因长度（基因间的比较）和总数据量（样本间的比较）做矫正；
RPKM的弊端
1）由于可变剪切，同一基因有效转录区域长度未必相同（这个一般情况下可以不考虑，了解一下：Cufflinks软件考虑了这个问题）优化策略：外显子或转录本水平的表达量分析。
2） 使用reads数计算基因表达量有轻微误差（这里暂不展开，主要了解一下定义）优化策略：FPKM或 TPM
3） mRNA的总量未必相等。 

RPKM的优化：FPKm

 F = Fragment，即测序片段数量。这些片段都是从完整的cDNA打碎而来的；

本质：以文库中的片段数量为计算单位在Paired-end测序中，一个fragment就是两条PE reads构成的片段。由于是PE比对，理论上比SE比对更可靠。 

RPKM的优化：TPM
T = Transcripts
本质：以转录本的条数为计算单位。使用转录本的条数（或者说：转录本的测序深度），代替reads数，在一定条件下定量更准，尤其样本间表达基因总数差异很大的时候（例如，对照样本有1万个基因表达，另外处理组仅有4000个基因表达）。 

mRNA总量未必相等
mRNA总量不等——细胞本身不同
例如：活跃组织vs休眠的组织；癌细胞vs正常细胞
mRNA总量不等——污染

例如：核糖体污染外源RNA污染 

解决方法——不同算法比较
其中归一化算法介绍：
1）Total Count（TC）：总reads数矫正
2）Upper Quartile（UQ）：上四分之一分位数（总reads）
矫正
3）Median（Med）；中位数（总reads数）矫正
4）Quantile (Q)：基因芯片软件limma中的校正算法；
5）RPKM：总reads数，但引入了基因长度
6）几何平均数：Deseq软件中的算法；
7）TMM：edgeR软件中的算法；
8）RPKM
逻辑1：不同位置数值的稳定性不同

四分位数quartile:将数据按从小到大排列，并分成四等分，这样得到3个分割点，第一个分割点叫做lowerquartile，第二个叫Media，第三个叫Upper quartile
很显然，极大值具有极大不稳定性，而且可能会显著影
响总体之和（假设，我们之中有个马云，我们的总收入
有什么变化？）
 所以，Upper quartile和Median的数值，比总表达量之
和更加稳定，更适合作为参照。
逻辑2：表达量居中的基因的表达量值，其数值应该是相似的。
DESeq与edgeR，默认情况下都使用这一的逻辑校正。（DESeq and edgeR Bioconductor packages） 

Deseq：异常高表达的基因，会显著影响细胞中的总mRNA的数量。类似的，如果样本中受到不同程度的外源RNA，如病毒、真菌等的污染，也会显著影响样本总mRNA数，导致RPMK值的误差。对于这样的问题，Deseq尝试对数据进行矫正（矫正因子），使表达量处于中间位置的基因表达量应该是基本相同的（即使用表达量处于中间的基因表达量值作为参照，而减少高表达基因的作用）。 

Deseq： 校正因子=样本表达中位数/所有样本表达量中位数：回答了一个关键的问题：Deseq不同差异比较组间，计算得到的表达量值不同。因
为样本在变化，“所有样本表达量的中位数”也在变动。RPKM：总表达量为参照

Deseq：中位数为参照 

TMM（edgeR）：与Deseq类似，在去除高表达基因和差异最大的基因后，TMM也是要找到一个加权系数，使剩余的基因在被矫正后差异倍数可能小。TMM的加权系数是基于两两样本比较后推算获得的（也就是两组样本的比较，将产生与这次比较相关的加权系数）。然后将所有基因除以这个加权系数，从而保证大部分表达量居中的基因表达量最相似。 

不同RNA-seq表达量归一化算法的区别
Deseq类的校正算法：理论上更加稳定；但不同批次的比较会得到不同的表达量值，不利于进行多处理组/批次数据的统一分析（例如，趋势分析、共表达分析）校正会掩盖一些问题（例如：样本污染）
RPKM类的算法： 容易受异常高表达基因、外源污染等的干扰；但也更容易从结果的异常中，发现潜在问题；得到的表达量值是恒定的，多处理组/批次的数据可以合并分析。折中的方法：使用RPKM类的算法，但需要人工检查数据是否
异常。备注： Deseq软件也可以关闭校正的功能。

实际经验总结

总之：从多方面考虑，RPKM类算法，如果合理使用，依然是最优的。具体问题具体分析：在遇到问题的时候，找到问题的来源，从而给出解决方案（没有完美的流程，只有最佳解决方案）