【实验视频】-手把手教你做动物实验（一）

说起生物医药科研界的让人撕心裂肺的实验，动物实验肯定是其中一大块。裸鼠成瘤，各种疾病造（zuo）模（nie），让我们饱尝与鼠小弟的相爱相杀。

既然有牺牲，除了有尊严，还得有价值。如何让鼠小弟们的牺牲换来的数据逼格更高？自然少不了时下最火爆的动物体内基因转染技术。

之前一篇文章里，老蔡曾跟大家分享了如何用AAV（腺相关病毒）实现精准且高效的动物靶器官基因转染（点击可直接查看），收到了不少亲的回复，希望能结合AAV的使用，讲一讲如何在各个脏器中进行AAV的活体注射。

其实，多脏器注射方式，说难也确实难，说不难也确实不难。

难！这么多脏器，这么多方法，都是精细操作，稍有不慎，鼠弟归天数据报销。

为啥又说不难呢？因为你要踩的坑，汉恒都帮你踩了！

汉恒动物实验组，专业填坑20年~汉恒不光讲给你听，而是立志把这些坑全拍成小电影show给你看！！

为了确保大家的动物实验顺利进行，汉恒整理了史上最全的AAV注射方法实验视频！

限于篇幅，下文详细介绍了3种注射方式，想要查看全部注射视频，请至汉恒公众号-推荐-视频专区。

不单单是AAV，其他的drug，particle的注射方式也如出一撤，只要你需要做到动物实验，汉恒动物实验视频一定会对你有所帮助。建议大家关注汉恒公众号，随时查看汉恒最新实验视频。

我们的口号是：”课题生生不息，视频更新不止！“

如果亲有特别想学习的动物视频，欢迎回复留言给老蔡！

来点干货吧！汉恒出品，必属精品！

汉恒多脏器AAV注射方式及注意点：

注射部位	汉恒推荐的血清型	注射方式	动物	注射体积（ ul）	备注
心脏	AAV9	原位多点注射（局部）	大鼠	10-15/点，5  个点	心肌主要有系统性给药、    原位给药和冠脉给药法，最常用的是前两种，冠脉法技术难度大，较少用。    **如需提高心肌特异性，您可配合使用汉恒筛选的心肌特异性启动子。
			小鼠	10-15/点，3-5  个点
		尾静脉注射（系统性）	大鼠	250（200g  体重）
			小鼠	100
肝脏	AAV8	尾静脉注射	大鼠	200（200g  体重）	大多数病毒都有嗜肝性，因此肝脏也是所有脏器中最好感染的。肝脏也可以用门静脉注射，感染效果更好。    但门静脉注射需行动物手术，技术复杂且易造成创伤。    **如需提高肝脏特异性，您可配合使用汉恒筛选的肝脏特异性启动子。
	AAV9		小鼠	100
全脑	AAV-BBB	尾静脉注射	大鼠	250-300	特殊血清型，可跨血脑屏障，感染全脑。    但经过汉恒验证，目前该血清型只适合大小鼠，在猴子上不成功。    **如需提高神经细胞特异性，您可配合使用汉恒筛选的神经特异性启动子，如pSyn，pCamKII，pGFAP等。
			小鼠	100
大脑（局部）	AAV9，AAV2，AAV5	立体定位注射	大鼠	1-5ul	经汉恒验证，AAV9型感染扩散范围广，    AAV2次之，AAV5扩散范围最小最集中    **如需提高神经细胞特异性，您可配合使用汉恒筛选的神经特异性启动子，如pSyn，pCamKII，pGFAP等。
			小鼠	0.2-2ul
脊髓	AAV5;    AAV1;AAV9	鞘内注射	大鼠	5-10ul	针头要足够细，找准椎骨之间空隙入针，避免损伤神经。    注射一定要缓慢，且控制好注射体积。
			小鼠
脂肪	汉恒脂肪特异性血清型	腹内脂肪-腹腔注射	大鼠	300	汉恒实验室自验证的脂肪特异性血清型
			小鼠	150-200
		皮下脂肪-原位注射	大鼠	10-15/点，5-8个点
			小鼠	10-15/点，5-8个点
骨骼肌	9型	原位多点注射	大鼠	10-15/点，3-5个点	下针缓慢，注意深度，
			小鼠	10-15/点，3-5个点
眼睛	汉恒AAV视网膜专用型	玻璃体腔注射	大鼠	3~5ul	汉恒实验室自验证的视网膜特异性血清型
			小鼠	1-2ul
	AAV-DJ	视网膜下腔注射	大鼠	3~5ul
			小鼠	1-2ul
肺脏	汉恒肺脏特异血清型	无创气管注射	大鼠	100-200ul（200g体重）	需呼吸机。汉恒也测试过滴鼻法，效果不如气管注射。
			小鼠	50-75
肾脏	2型或9型	肾脏肾盂原位注射	小鼠	100ul	较为复杂，方法详见汉恒公众号实验视频
肠道	1型或5型	灌肠	大鼠	1000ul（200g  体重）	动物需要提前饥饿，排空肠道。病毒用量非常大。
			小鼠	500ul
血管    （内皮为主）	1型或5型	腹主动脉局部感染	大鼠	50ul	局部感染30分钟，感染时需要clamped肾主动脉

部分注射视频详解：

尾静脉注射

感染部位：心脏、肝脏、AAV-BBB感染全脑

1、把小鼠放入尾静脉注射的装置中（如果没有该装置，可以用50ml的离心管自己制备一个，注意通气、固定即可）。

2、用70%的酒精消毒小鼠尾部。注意保持下属尾部温暖，太冷的话血管会收缩。 

3、用左手食指拇指拉住小鼠尾巴，稍用力拉直，然后食指稍微向前向上，使尾巴稍微弯折。可以在弯折处进针注射病毒（27-30G胰岛素针，100ul/小鼠）。

4、缓缓注射，完成后保持5-10秒防止病毒回流。

5、拔针，用手指或者干的无菌棉球或纱布按压几秒。

鞘内注射

感染部位：脊髓神经

1、麻醉-皮下注射麻醉剂 Xylazin/Ketamine 混合液（10mg/kg,100 mg/kg ）（Xylazin/Ketamine，Sigma-Aldrich X1251, K2753）。

2、在小鼠的眼睛上涂上眼药膏（Oculentum simplex， Teva Pharmachemie），防止眼睛干掉。 

3、靠近小鼠的尾部根部约2cm2皮肤去毛，以利于清晰看见下针部位。 

4、把小鼠放到一个特殊的架子上，在小鼠下本身用一根15ml离心管垫起，从而使下针部位稍微拱起。 

5、把病毒吸入25微升的hamilton，配30G针头。

6、定位脊椎的L6（最突出的一个），并用手指轻轻按压使之平缓。 

7、小心将针头插入L5椎骨和L6椎骨的凹槽之间，并注意小鼠尾部会稍微上翘，这标志针头成功插入

髓鞘。 

8、一旦成功插入，用手指固定针头，另一只手缓慢注射5-10微升病毒。注意注射体积要适当，太小会加大实验误差，体积太大会增加鞘内压力。 

9、如有需要，24hr之后可重复注射一次。 

10、实验完毕需要保持小鼠身体足够温暖（比如37度加热灯、温箱等），以利于苏醒。

脑立体定位注射

感染部位：脑部

1、麻醉-皮下注射麻醉剂Xylazin/Ketamine 混合液（10mg/kg, 100 mg/kg ）（Xylazin/Ketamine，Sigma-Aldrich X1251, K2753）。

2、剃除小鼠头部眼睛到耳朵之间的毛发，放到立体定位仪的保暖托盘上。

3、归零牙齿和耳朵的标尺。并在小鼠的眼睛上涂上眼药膏（Oculentumsimplex， Teva Pharmachemie），防止眼睛干掉。

4、将小鼠上门牙固定到固定板的槽内，确保头部保持固定。调节Bregma和Lambma在同一矢状线上和水平面。务必确保小鼠鼻子居中、稳定。

5、用手术刀花开小鼠头部皮肤，用手术刀刮掉表面硬脑膜，如有血迹请用棉签擦干，确保bregma 和lambda位置清晰可见（加示意图）。

6、把bregma 坐标归位0（X，Y，Z=0），确保lambda位置与bregma位于同意水平面上。

7、根据目的脑区设定好坐标。一旦坐标固定，用marker笔在颅骨做出标记，并在10秒内在颅骨钻出一个约0.015mm的孔。钻的过程务必小心，以防损伤脑组织。

8、把带注射AAV吸入针内，根据上一步设好的坐标进针。进针完成后以0.05-0.1 微升/min的速度缓缓注射病毒，通常一只小鼠注射体积在0.05-2微升之间。

9、注射完毕，保持10min，然后慢慢回针。

10、操作过程中如有血流出需要用棉签及时吸干。