PD-1/PD-L1免疫联合治疗多发性骨髓瘤中效果显著

这篇发表于Blood的文章首次临床试验证明了PD-1/PD-L1 联合靶向疗法的临床有效性。

鉴于其重要意义，我们的技术专家又划了次重点。曾经不小心错过该文的您，几分钟就能快速get要点。

先说结论： 联合疗法的有效性及PD-L1 表达作为有效性衡量的潜在标记。 

• 这是第一次在多发性骨髓瘤尝试使用派姆单抗（PD-1单抗, Pembrolizumab）+ 泊马度胺（pomalidomide, 免疫调节药物）联用治疗方案，且取得了良好的疗效。可使RRMM患者产生高的总体反应率（ORR 60%），且耐受性良好。

  
  

• 证明在使用PD-1通路阻遏药物进行多发性骨髓瘤治疗时， PD-L1(骨髓瘤中表达的)和PD-1 (骨髓浸润的T淋巴细胞中的) 均可作为潜在的生物标志物。

特色

首次建立了在BM （immunologic bone marrow）活检中进行PD-L1 免疫组化的新方法 （具体方法见下文）。

数据：临床II期实验，历时2年多

1.联合用药客观反应（Objective responses）良好

图1 治疗反应（原图fig.2A）

PR : 部分缓解, VGPR：非常好的部分缓解, sCR/CR：严格的完全缓解/完全缓解。

48名RRMM患者，给予静脉注射派姆单抗200 mg，每2周1次，泊马度胺口服4 mg每日1次，持续21天，地塞米松口服40 mg每周1次，28天为1周期。这些患者既往接受的治疗中位数为3（2-5），中位年龄为64岁（35-83），所有患者已接受过IMiD和蛋白酶体抑制剂治疗：73%（35/48）的患者对IMiDs和蛋白酶体抑制剂难治，70%（31）的患者曾接受过自体干细胞移植，62%（30）的患者存在高危遗传学特征。

治疗反应显示40%（19/48）的患者发生了3-4级不良反应：包括血液学毒性40%（19），高血糖25%（12）和肺炎15%（7）。自身免疫反应包括肺炎13%（6）和甲状腺功能减退症10%（5），多数小于2级，中断治疗即可恢复。

• 患者客观反应良好

60%（29/48）患者产生了客观反应(见图1)，其中8%（4）得到了严格的完全缓解/完全缓解（sCR/CR），19%（9）有非常好的部分缓解（VGPR）和33%（16）得到了部分缓解（PR）（图1 A）；中位反应持续时间为14.7个月，中位随访15.6个月，无进展生存期（PFS）为17.4个月，总生存期（OS）未达。

2.IHC显示PD-L1阳性病人与治疗反应相关

图2 PD-1和PD-L1免疫组化分析（原图Fig.4）

Negative＜1% (i)，weakly 1% to 49% (ii), positive ＞50% (iii)；positive (≥5% CD3,  ≥1% PD-1)

上述结果令人振奋，为了探究PD-1和PD-L1的表达与MM治疗效果之间是否存在相关性，作者对治疗前的患者进行了PD-1（图Bii）和PD-L1（图A上）的IHC分析。为了更准确的统计PD-1和PD-L1的IHC结果，T淋巴细胞标志物CD3（图Bi）和骨髓瘤细胞标志物MUM1（图A下）也被共染。PD-L1评分规则：呈现任何强度的细胞膜阳性染色的肿瘤细胞的百分率。

29 例病人治疗前骨髓瘤细胞中PD-L1 IHC显示（图2A）：10例阴性 ，6例弱阳性，13例阳性。对应的客观缓解率分别为60%, 50%和 77%。PD-L1阳性病人vs阴性和弱阳性病人的治疗反应（VGPR+sCR/CR）为54%vs20%，但PFS却与此无相关性。

3.PD-1 与ORR无明显相关性

对38例病人进行了淋巴细胞中的PD-1的组化检测显示（图2B）：6例CD-3+/PD-1+（激活的T细胞），10例CD-3+/PD-1-（非激活的T细胞），22例无明显的T细胞浸润CD-3-/PD-1- （未检到T细胞），骨髓浸润的淋巴细胞中PD-1的表达与客观缓解率（ORR）并无明显的相关性，但有一个趋势值得注意：PD-1阴性的患者PFS似乎更高。

表（1）PD-L1和PD-1与PFS的相关性。

PD-L1：Negative＜1%，weakly 1% to 49%，positive ＞50%；PD-1：≥5% CD3,  ≥1% PD-1。

背景: 长知识

1.关于MM

多发性骨髓瘤（MM）发病率占所有恶性肿瘤的1%，占血液肿瘤的13%，其特征是骨髓恶性浆细胞浸润伴随外周血高水平的免疫球蛋白（M蛋白）不可控的浆细胞恶性增殖。大部分无法完全治愈，被称作复发/难治性MM（RRMM）。

2.为什么想到进行联合用药？

1. 免疫调节剂和蛋白激酶抑制剂治疗有疗效，但是病人容易引起耐药。

2. PD1/PD-L1 阻断疗法正成为癌症治疗靶标，在多个实体瘤及恶性血液肿瘤有显著疗效。肿瘤细胞高表达PD-1的配体PD-L1和PD-L2，抑制T细胞杀伤肿瘤细胞的功能。因此阻断这一通路可以部分恢复T细胞的功能，使这些T细胞能够继续杀伤肿瘤细胞，如PD-1抗体-派姆单抗（Pembrolizumab）。

3. PD-L1 在MM 中高表达，且在复发及治疗后的MM中表达更高。高表达的PD-L1与MM 转变风险相关。另一方面，PD-L1 表达显示可导致MM细胞的抗药性。表达的PD-L1 在抗原递呈DCs细胞中起到促进肿瘤，提供MM中的免疫抑制微环境。

4. PD-1在抗原激活的及‘耗竭’ (exhausted) T细胞，NK细胞，DCs 细胞中均有表达。 该表达导致了细胞毒性T 淋巴的功能紊乱.

5. 近期研究发现MM中的T细胞呈现低表达的PD-1。表明这些细胞还未‘耗竭’，单一免疫阻断效果不是很明显。

综上所述，为了恢复MM中效应T细胞功能， 需要将其他免疫刺激策略与PD1/PD-L1 联合起来。 

3.与何种免疫调节药物联合？ Pomalidomide

选择Pomalidomide该肿瘤调节药（IMiDs）的原因有几个方面：

1. 它除了能够诱导骨髓瘤细胞凋亡外，还可通过刺激效应细胞毒T细胞及NK 细胞，抑制调节型T细胞，改变一些列细胞因子如IFN-γ，IL-2等，进而增强骨髓微环境。

2. 体外实验显示，Pomalidomide可降低T细胞PD-1的表达，增强T细胞对异源DCs的增殖反应。体内实验也说明Pomalidomide可刺激多种细胞因子的产生 如IFN-γ，肿瘤坏死因子TNF-α、IL-2、IL-4。它也可诱导多功能T细胞的激活（尤其是CD8+ T细胞），增加共抑制免疫检验点BTLA T细胞及表达T细胞免疫球蛋白及粘蛋白结构域分子3 NK 细胞的比例， 但对PD-1+ T 细胞不产生影响。

特色研究方法

BM 活检IHC新方法

• 预处理的骨髓样本经福尔马林溶液固定，石蜡包埋，进行IHC检测。

• 用Immunocal (Stat Laboratory)做脱钙处理，37°C 90分钟标准化流程。

• PD-L1检测(E.H.代做的)用的是兔单克隆抗体，克隆号为28-8的abcam 抗体（ab205921），搭配Envision Flex兔检测系统和Envision Flex兔linker(DAKO)。

• 抗原修复用的是抗原修复锅和靶标修复溶液pH 6.0 (DAKO)。IHC在自动IHC/原位杂交平台. Bond-III (Leica Microsystems)上做的。阳性对照为脱钙的扁桃体，经过固定。

• 为了控制PD-L1打分仅针对骨髓瘤细胞，PD-L1染色的切片还用了小鼠单抗anti-MUM1 (clone MUM1p) (DAKO; catalog number M7259)进行复染。持续的膜染色被视为阳性。

• 细胞中PD-L1表达量低于1%，视为阴性；评分在1%~49%为弱阳性，大于50%为阳性。对于T细胞，用CD3单抗（DAKO）和PD-1单抗（Abcam，克隆号NAT105）。CD3 和 PD-1 IHC 染色被分为阴性 (<5% for="" cd3,=""><1% for="" pd-1)或者阳性="" (≥5%="" for="" cd3,="" ≥1%="" for="" pd-1)。骨髓淋巴细胞被分为三类:="" cd-3+/pd-1+="" (激活的="" t="" 细胞),="" cd3+/pd-1−="" (非活化的="" t="" 细胞)，以及cd-3−/pd-1−="">

推荐研究工具

1）PD-L1/PD-1 定量检测

靶点	PD-L1	PD-L1	PD1
反应性	Human	Human	Mouse
类型	一步法ELISA	一步法荧光ELISA	一步法ELISA
检测范围(pg/ml)	21.87-1400	2.73-2800	125-8000
货号	ab214565	ab229414	ab210971
备注	*	*

* 使用PD-L1 [28-8]作为捕获抗体

** 一步法ELISA可以90分钟完成ELISA实验

2）IHC必备试剂

a. 高温/PH恒定的抗原修复液 (ab208572) ，克隆号为 28-8的PD-L1 抗体推荐搭配此试剂*

b. Polymer HRP显色系统(ab209101)  ，克隆号为 28-8的PD-L1 抗体推荐搭配此试剂*

c. 推荐一抗同型对照:  (ab172730) 

d. 推荐Anti-PD1 antibody [NAT105] (ab52587)

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