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当前结核病耐药情况如何？ 结核病（TB）是全球及我国严重的公共卫生问题，TB耐药情况也相当严重，根据世界卫生组织报道，2016年全球新发TB患者1040万，130万人死于TB；60万新发TB患者耐利福平（RR-TB），其中49万是耐多药结核病（MDR-TB）患者，MDR/RR-TB在新发TB患者中的发生率约4.1%，在已治疗患者中约19%；MDR-TB患者中XDR-TB占6.2%。耐药TB病例47%发生于印度、中国和俄罗斯。2016年我国新发TB患者89.5万，MDR/RR-TB发生率是5.2%。因此，耐药TB尤其是MDR-TB、广泛耐药结核病（XDR-TB）的快速诊断和有效治疗是当前TB防控中亟需解决的难题。 结核菌是如何发生耐药的？ 结核菌耐药机制尚未完全搞清楚，但目前已发现下列耐药机制： （1）抗结核药物作用靶标或药物代谢酶改变，这是大多数结核菌耐药的分子机制； （2）抗结核药物外排泵过表达导致活性增高或外排泵基因的转录调节子表达激活均会导致结核菌耐药； （3）结核菌细胞壁渗透性改变或细胞壁缺陷如L型也可能是耐药产生的原因； （4）结核菌双组分系统可能通过调控外排泵或细胞壁渗透性而导致耐药。 目前结核菌已发现的常见耐药基因突变有哪些？ 1．利福霉素类药物：利福平（RFP）、利福喷丁（RFT）和利福布丁（RFB）均为一线抗结核药物，其作用靶标RNA聚合酶α、β、β'亚单位编码基因rpoA、rpoB、rpoC突变均可能导致Mtb对其耐受。其中95%左右的突变发生在rpoB507至533位氨基酸密码子，最常见的突变位点是531位和526位氨基酸密码子。 2．异烟肼及异烟酸衍生物：结核菌耐异烟肼（INH）主要与过氧化氢酶-过氧化物酶编码基因（katG）缺失或突变以及烯酰基运载蛋白还原酶的调控基因（inhA）突变有关；KatG315位密码子和inhA-15位是最常见突变位点。而异烟酸衍生物丙硫异烟胺（PTO）和乙硫异烟胺（ETO）耐药主要是由于参与分枝菌酸合成的inhA编码基因和启动子区域及其激活剂单氧酶编码基因ethA突变所致。 3．乙胺丁醇：结核菌耐乙胺丁醇（EMB）与阿拉伯糖基转移酶编码基因embA、embB和embC表达增高或突变有关，其中embB306位密码子是最常见突变位点。 4．吡嗪酰胺：结核菌耐吡嗪酰胺（PZA）主要是由于吡嗪酰胺酶编码基因pncA、核糖体蛋白S1编码基因rpsA和天冬氨酸脱羧酶基因panD突变所致，其中pncA编码基因突变是最常见原因，相对热点区域位于3～17、61～85和132～142位密码子。但应注意的是，部分pncA突变与耐药无关。 5.链霉素：结核菌耐链霉素（SM）是由于其核糖体蛋白S12编码基因rpsL和16S rRNA编码基因rrs突变所致。RpsL43位和88位密码子及rrs905位和513位核苷酸是最常见的突变位点。 6．喹诺酮类药物：结核菌耐喹诺酮类药物主要是其DNA旋转酶的A亚单位编码基因gyrA或B亚单位编码基因gyrB突变所致，其中gyrA67～106位密码子是结核菌喹诺酮耐药决定区（QRDR）。 7. 卡那霉素、氨基羟丁基卡那霉素A、卷曲霉素和紫霉素：结核菌耐卡那霉素（KM）、氨基羟丁基卡那霉素A（AK）、卷曲霉素(CAP)和紫霉素（VIO）主要与rrs基因突变有关，其中A1401G置换是最常见的突变。此外，rRNA转甲基酶编码基因tlyA（rv1694）突变也会导致CPM和VM耐药。 8. 贝达喹啉和氯法齐明：Rv0678和pepQ(rv2535)基因突变均会导致结核菌对贝达喹啉(BDQ)和氯法齐明(CFZ)低水平的耐受，使两者产生交叉耐药性。此外，rv1979c突变也会导致结核菌耐受CFZ。 9.PA-824和德拉马尼：结核菌耐受PA-824和德拉马尼主要是由于F 420依赖的生物激活途径中的下列5个基因突变所致：硝基还原酶基因ddn、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因fgd1、2-磷酸-L-乳酸转移酶基因fbiA、fbiB和7,8-二脱甲基-8-羟基-5'脱氮核黄素-5'-磷酸盐合成酶基因fbiC。 10.大环内脂类药物：结核菌耐大环内脂类药物可能与其存在单甲基化转移酶ermMT（rv1988）和膜外排泵编码基因Tap(rv1258)有关，使其对该类药物呈天然抗性。 11. 环丝氨酸：结核菌耐环丝氨酸（CS）可能与谷氨酸脱羧酶编码基因gadA、D-丙氨酸消旋酶编码基因alrA(rv3423c)、D-丙氨酸连接酶编码基因ddlA(rv2981c)和L-丙氨酸脱氢酶编码基因ald(rv2780)突变有关。 如何检测结核菌是否耐药？ 目前主要采用下列两种方法：表型药敏方法和分子药敏方法。表型药敏方法是建立在培养基础上的，通过观察结核菌在含药培养基中的生长情况来检测其耐药性,是目前耐药检测的金标准。由于结核菌慢生长的特性决定了该方法需较长时间，但其可检测较多种类药物的耐药性。分子药敏方法是采用分子生物学技术检测、鉴定结核菌的耐药基因突变型。分子检测的优点是可快速、灵敏地从临床标本中检出耐药结核菌，甚至涂阴、培阴的标本，但检测的药物种类有限。目前任何单一的药物敏感性检测方法并不能完全满足临床需求，通常可检测十几种药物的表型药敏方法与快速检测部分药物耐药基因型的分子药敏方法相结合，优势互补，为临床快速诊断和有效治疗耐药TB提供实验依据。 目前表型药敏方法有哪些？ 目前可在我国临床应用的表型药敏方法主要有下列三类： 1. 传统的药敏试验方法：在含抗结核药物的固体培养基上，检测结核菌的生长情况以判断其对药物的敏感性，我国常用绝对浓度法和比例法。WHO建议采用比例法作为药敏试验的标准，当耐药菌比率超过1%时即可诊断耐药。该方法的优点是可同时检测结核菌对十几种一线和二线抗结核药物的单药和两种药物联合的耐受水平，简单、经济，适用于基层；其缺点是培养时间长，通常需1-2月时间。 2．分枝杆菌快速培养药敏试验方法：在含抗结核药物的液体培养基中，通过BACTEC MGIT 960和BacT/ALERT3D分枝杆菌快速培养系统检测4-5种一线抗结核药物的药敏试验，其优点是较快速，只需1-2周时间；其缺点是进口试剂成本高，目前尚不能检测二线抗结核药物的敏感性。 3.分枝杆菌药敏检测板：美国赛默飞世尔科技有限公司（Thermo Scientific）基于微量肉汤稀释法原理开发的分枝杆菌药敏检测板Sensititre® MYCOTB，可检测12种一线和二线抗结核药物[包括RFP、RFB、INH、EMB、SM、氧氟沙星(OFX)、莫西沙星(MFX)、阿米卡星(AM)、对氨基水杨酸(PAS)、ETO、KM、CS]的耐药性，只需10天时间。其优点是可获得抗结核药物的最低抑菌浓度（MICs），为临床提供更确切的耐药信息；缺点是实际应用中某些药物的MIC值不好判读。 目前分子药敏方法有哪些？ 目前可在我国临床应用的分子药敏或耐药基因检测方法主要有下列四类： 1.Xpert MTB/RIF试验：是美国Cepheid公司开发的一种基于GeneXpert核酸提取、扩增、检测一体化系统的结核菌和RFP耐药快速检测试剂盒，其优点是自动化地同时检测结核菌基因及RFP耐药基因型，操作简便，即时检测，快速只需110分钟，样本裂解、核酸提取、PCR体系配置、扩增和检测步骤全部在密封体系中完成，生物安全性高，无需专门的分子生物学实验室；缺点是只能检测一个抗结核药物RFP的耐药性。 2. MeltPro M.tb耐药检测系统：我国厦门致善生物科技股份有限公司产品，其采用多色探针熔解曲线法快速检测结核菌RFP、INH、SM、EMB和氟喹诺酮类药物的耐药基因型，优点是较简便、快速、闭管检测，无需繁琐的杂交、显色过程，只需2-3小时，可较全面地了解耐药基因突变信息；缺点是不报告具体的突变类型。 3. 晶芯®MTB耐药检测基因芯片：我国北京博奥生物集团有限公司产品，可快速检测结核菌RFP和INH常见耐药基因型，只需1天时间。其优点是较简便、快速；缺点是杂交、检测过程较繁琐。 4. 耐药结核分枝杆菌诊断试剂（线性探针实验）：德国Hain生命科学公司开发的GenoType ® MTBDRplus检测试剂盒可同时检测RFP和INH耐药基因型，GenoType ® MTBDRsl检测试剂盒可同时检测EMB、喹诺酮类、氨基糖苷类耐药基因型，只需1-2天时间。其优点是较简便、快速；缺点是杂交、显色过程较繁琐。 如何理解药敏试验结果的临床意义？ 药敏试验结果可使临床医师了解患者体内结核菌对各种抗结核药物是敏感还是耐药，指导临床医师选择合适的药物组成合理的化疗方案，尤其对复治和难治患者更有实用价值。 药敏试验结果显示对任何1种抗结核药物耐药，被称为单耐药(mono-resistance)；对2种以上抗结核药物耐药，但不同时包括INH和RFP，被称为多耐药(poly-resistance)；同时对INH和RFP耐药，被称为耐多药(multi-drug resistance，MDR)；同时对INH、RFP、氟喹咯酮类、一种注射针剂耐药，被称为广泛耐药（extensive drug resistance, XDR）；同时对所有抗结核药物耐药，被称为完全耐药（total drug resistance, TDR)。 通过药敏试验所揭示的下列临床意义值得临床医师关注： 1.我国TB患者中，RFP耐药90%～95%是由于rpoB突变所致，其中531位、526位和513位密码子突变通常导致大多数结核菌对RFP、RFT高水平耐药，而对RFB高水平和低水平的耐药各占一半；514和533位密码子突变一般导致低水平耐药；508位和509位氨基酸置换已证实与耐RFP无关。RFP分子药敏检测结果与表型药敏试验结果具有较好的一致性，RFP与RFT和RFB有70-90%的交叉耐药率。因此，RFP耐药一般不主张更换为RFT，是否更换为RFB需根据表型药敏结果确定，RR-TB通常采用二线抗结核药物治疗。 2.我国TB患者中，INH耐药70%～80%是由于katG315位密码子突变所致，应认识到该突变只是导致katG酶活性降低，但仍能催化INH转换为其活性型异烟酸而发挥抗结核作用，只是转换效率降低，表型药敏试验通常表现为结核菌对INH低水平耐受或敏感，建议临床上加大INH剂量或加用PAS或更换为PAS-INH或PTO或ETO。10%左右患者Mtb katG完全缺失，一般会导致高水平耐INH，继续应用INH治疗效果不理想，建议更换为PTO或ETO。10％左右患者结核菌菌株inhA-15位核苷酸突变，表型药敏试验通常表现为结核菌对INH、PTO、ETO低、中或高水平耐受或敏感。因此，inhA-15位突变会导致INH与PTO、ETO有一定的交叉耐药性。 3. 我国TB患者中，大多数EMB耐药是由于embB基因突变所致，47％～89％发生在306位密码子。EmbB306位氨基酸置换通常导致结核菌对EMB中等水平耐药，但临床上适度增加EMB的剂量仍有效。因此，建议常规的EMB药敏试验结合embB306基因检测，以指导EMB剂量的调整。 4. GyrA突变通常导致结核菌中、高水平耐受喹诺酮类药物，如存在gyrA突变的耐环丙沙星（CIP）菌株通常MICs>2ug/ml。75%～94%的耐CIP结核菌菌株、87%的耐MFX菌株和83%的耐OFX菌株存在gyrA突变，其中94位Asp→Asn或His或Gly或Tyr或Ala和90位Ala→Val是较常见的突变位点。GyrA Ala90Val突变株的MXF MICs通常低于OFX，Ala90Val和Ser91Pro突变患者仍可采用标准MXF剂量或增加MXF剂量治疗；而94位突变菌株对MXF呈现中等水平耐药(MIC=2.5μg/ml)，其临床意义尚需进一步研究。GyrB突变通常导致低度耐喹诺酮，gyrB突变率很低。 5. EthA突变通常导致结核菌高耐ETO，大约76%的分离株ETO MICs>50ug/ml，与氨硫脲、戊氧苯硫脲（thiocarlide）有广泛的交叉耐药性。 6. Rrs基因突变通常导致结核菌高耐KM、AK、CAP和VIO，这4个药之间通常存在不同程度的交叉耐药性，最常见的突变是A1401G（50－60%）。CPM和KM耐药率明显高于AK，AK高水平耐药株一般也高耐KM、低耐CAP；CAP耐药率高，大多数为低水平耐药。但基因型和表型之间存在一定的差异，rrsA1401G突变可引起KM、AK 和CAP耐受，但VIO敏感；tlyA和rrsA1401G同时突变时，KM和AK MICs与rrsA1401G突变株相似，但CAP和VIO MICs高于tlyA突变株或rrsA1401G突变株；KM低水平耐受时一般CAP敏感，而且无rrs突变；KM高水平耐受时一般对CAP也耐受，有rrsA1401G或G1484T突变。 7.异质性耐药问题：临床标本中的结核菌通常即有敏感菌株、也有耐药菌株，治疗前敏感菌株占优势，有效治疗1-2个月后，敏感菌株逐渐被杀灭，耐药菌株逐渐占优势，药敏试验可能由敏感转为耐药。当基因型药敏检测与表型药敏检测结果不一致时，或同时检出敏感基因型和耐药基因型时，均说明可能存在异质性耐药。因此，疗程中应定期监测药物敏感性，并及时调整化疗方案。但分子药敏检测方法通常需耐药菌株占20-40%比例方能检出，其检测异质性耐药的灵敏度显著低于表型药敏检测方法。 》专家简介《 吴雪琼 解放军第三〇九医院研究员，博士生导师，全军结核病研究所副所长，全军结核病防治重点实验室/结核病诊疗新技术北京市重点实验室主任。享受政府特殊津贴，先后被评为“第二届全国中青年医学科技之星”、解放军总后勤部“科技新星”、“第二届总后学习成才标兵”、解放军总参谋部“优秀中青年专家”。主要从事结核病基础和临床研究，获军队医疗成果一等奖2项，国家科技进步三等奖1项，军队科技进步二等奖3项，军队医疗成果二等奖、中华医学科技二等奖、华夏医学科技奖二等奖各1项；研发了10个诊断试剂盒或仪器和4个治疗制剂，获得国家发明专利14项，成果转化产品13项，其中2个已获欧盟CE证书，7个获中国医疗注册证书，1个已获新药证书，1个获国家药监局临床批件、完成I期临床试验，1个获军队制剂临床研究批件；主编中国第一部《分枝杆菌分子生物学》和《结核病免疫学》专著，副主编和参编专著18部，制作VCD教学片2个；发表中英文论文400余篇。 |
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