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荧光是指一种光致发光的现象。当某种常温物质经某种波长的入射光照射，吸收光能后分子中的电子达到高的能阶，进入激发状态，并且立即退激发，恢复到原有的状态，同时多余的能量就以光的形式辐射出来，即发出比入射光的波长更长的发射光（通常在可见光波段）。一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。这就是说，当一个物体吸收了短波光的能量，它能发射出比原来吸收的波长更长的光。具有这种性质的物质或者分子称为荧光素或荧光染料。 当激光光束与细胞正交时，一般会产生两种荧光信号。一种是细胞自身在激光照射下发出微弱的荧光信号，称为细胞自发荧光；另一种是经过特异荧光素标记细胞后，受激发照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信号的检测和定量分析就能了解所研究细胞参数的存在与定量。 如下图，荧光产品示意图：
（一）荧光信号的意义 荧光信号可以反映不同细胞的生物学特性。如用荧光染料标记的单克隆抗体特异的与细胞表面的抗原、受体或膜糖蛋白结合，在激光的激发下，发出一定波长的荧光。荧光信号的强度反映了膜抗原、受体或糖蛋白的相对数量，对荧光信号进行收集分析，就可以实现对细胞亚群和功能等的分析。用DNA染料对DNA进行染色，染料通过一定的方式与DNA链接合，在激光的激发下，染料发出荧光，测定荧光的强度，就可以得出相对的DNA含量，进而可对细胞周期时相进行分析。使用特定的荧光染料还可对细胞钙离子浓度、细胞内PH以及细胞膜电位等进行测定。 （二）荧光染料的选择 可选用的荧光染料多种多样，由于他们的分子结构不同，其荧光激发谱与发射谱也各异。选择染料或单抗所标记的荧光素必须考虑仪器所配置的激光光源的波长，即染料的激发光谱；仪器激光的激发光波长尽可能接近荧光染料的激发光谱峰值；此外，还要考虑荧光染料的发光颜色，即染料的发射光谱，需选择合适波段的检测器检测相应的荧光信号。 由于现在的流式细胞仪都装有多个荧光信号检测器，仪器在同时检测多种荧光时，每个荧光检测器只允许一种指定波长的荧光信号进入并被检测，因此使用者必须选用适当的荧光信号接收器，才能收到最佳的信号。还要注意使用由同一波长激光的荧光染料，其发射波长不同，才可以用相应波段的检测器接收，达到同时检测的目的。 选择检测器的依据就是要了解荧光染料的发射谱。以三色FCM为例，如果荧光光谱峰值落在绿色范围（波长515-545nm），选用第一荧光检测器；如果光谱值落在橙红色范围（564-606nm），选用第二荧光检测器；如果荧光光谱值落在深红色范围（波长）650nm），选用第三荧光检测器。目前台式FCM常配置的激光器为波长488nm，通常可用的染料有PI、PE、FITC、PERCP、CY5等。 （三）荧光标记抗体组合 在进行流式细胞仪多色分析时，如果想得到理想的分析结果，就需要选择好抗体的荧光搭配。常考虑的影响因素有以下几点。 1 荧光素的荧光强度 一个特定抗体，能否区分阴性与阳性结果，取决于该抗体用何种荧光素标记。每一种荧光素的光量子释放能力不同，相对荧光强度不一样，一般用染色指数（staining index）来比较不同荧光标记的光信号强度。染色指数是阳性信号和阴性信号差异与阴性峰分布宽度比值，是判断该荧光染料辨别弱阳性表达的能力。如下图显示了用8种不同的荧光素标记相同的单克隆抗体，得到了不同的染色结果，我们需要从中寻找染色指数较高的荧光染料，去标记表达弱的信号。 由此可以看出：对于特定的单克隆抗体，由于使用了不同的荧光素标记，其阴性细胞核阳性细胞的S/N比值（信噪比）可以相差4-6倍。一般来讲，荧光信号由强到弱的的排序是：PE>APC>PE-CY5>PERCP-CY5.5>FITC>PERCP。 在选择荧光标记抗体时，需要综合以下方面的因素： 荧光素标记效率：抗体上标记荧光素的数量（F/P）值也会影响相对荧光强度。每一个抗体上可标记几个FITC或PERCP分子（通常为2-9个），而APC和PE的标记量约为每个抗体标记一个荧光分子。FITC为小分子化合物，而PE，PERCP和APC则是分子量较大的荧光蛋白。受荧光标记物的化学性质要求限制，IGM型抗体通常只用小分子的荧光素进行标记，如FITC、TEXAS RED、CY3和CY5。 抗体检测的抗原密度：高表达的抗原几乎可以用任何荧光素标记的抗体检测，而较低表达的抗原则需要用较高S/N比值的荧光素标记的抗体检测，从而达到有效区分阳性细胞群和阴性细胞的目的。 细胞自发荧光：每个细胞群体的自发荧光水平都不同，尽管可以观察到高荧光强度的细胞，但自发荧光在高波长范围里（>600nm）迅速降低。检测自发荧光水平高的细胞时，使用发射光波长较长的荧光染料比如APC可以得到较好的S/N比值。如果是自发荧光水平不太高的细胞，那么，使用较长波长的激发光激发，对于提高阳性、阴性差别的现象影响不明显。可以使用FITC标记的抗体。 2 非特异性结合 有些荧光标记的抗体会表现出低水平的非特异性结合，就会造成阴性细胞的荧光水平升高。这种非特异性结合通常由以下两种因素造成： 单克隆抗体的同型对照：一些IGG型同型对照更易于某些类型的细胞的FC受体结合 使用的荧光素：有时CY3，CY5，CY5.5和Texas Red直接标记的抗体，以及某些tandom偶联抗体，与某些细胞亚群的结合性增强。对于CY5来说，研究表明，这主要是由于染料与低亲和性FC受体的弱相互作用造成的；PE-CY5标记的抗体也有类似作用。另外，在某些情况下（如用抗HLA-DG PE/抗单核细胞PerCP-CY5.5分析单核细胞），也可以利用这种特性，有意在标记抗体是增加CY染料的标记量，这样就可以保证无论每个单核细胞的CD14表达水平的高低差别有多少，都可以检测到单核细胞 总之，在进行流式细胞仪多色分析时，应慎重选择荧光抗体标记的荧光染料。主要影响因素有：根据不同型号选择适当的荧光抗体（激光功率和波长）；染色细胞的抗原表达的相对密度（对于低表达密度的抗原，应该选择更亮的荧光染料）；阴性细胞上的FC受体情况。此外，做多色分析时，要尽量选择荧光波普间的光谱重叠较小的荧光染料进行组合，同时需要正确的调整补偿。 3.荧光补偿的调节 当细胞携带两种或者以上荧光素（比如PE和FITC），受激光激发而发射两种以上不同波长的荧光时，理论上可选择滤片使每种荧光仅被相应的检测器检测到，而不会检测到另外一种荧光。但由于目前所使用的各种荧光染料都是宽发射谱性质，虽然他们之间各自发射的峰值不相同，但发射谱范围有一定的重叠，因而少量不需要检测的另一种荧光信号也会被此光电倍增管所检测，所以每一个光电倍增管实际上检测到都是两种荧光之和，但各以某一种荧光为主。如图可以看出，荧光素的发射波谱有一定范围，其发射信号势必会有极少部分进入到另一个检测当中。图中阴影为探测器检测光谱的范围，FITC探测器会检测到少量的PE光谱，而PE光谱探测器检测到较多的FITC光谱。 由于光谱重叠的部分占检测信号的一定比例，因此，荧光补偿的方法就是：从所接收的荧光信号中，把另一个检测器中接收信号的一部分（即光谱重叠的部分）减去，使另一个检测器信号在此检测器中检测的信号与阴性背景信号一致，这样，该光电倍增管中输出的信号真正只代表指定检测的信号，而没有另一波长的荧光信号的干扰。利用标准的已知单阳性样本，可合理设置荧光信号的补偿值。补偿的程度可用双荧光参数同时测定的仪器条件来决定。补偿时先测定一种染料的荧光（FL1），此时除了应该接收该荧光的光电倍增管如FL1检测器有信号输出外，另一光电倍增管FL2检测器也常会有微弱的输出，调节补偿器FL2-%1FL1，使FL2检测器输出的平均荧光强度与阴性信号一致；然后再测另一种染料（FL2），再调整补偿器FL1-%FL2，使FL1检测器输出的平均荧光强度与阴性信号一致。如此反复调节，则FL1和FL2检测器就可全获补偿。 做多色分析时，必须分别使用各个荧光素单阳性的样本做检测，调整与其他各荧光通道的补偿，以保证多色分析结果的准确性。由于多色分析荧光补偿的复杂性，许多分析软件都允许做脱机补偿，这位操作者提供了很大的方便。 需要注意的是，补偿与特定实验的特定荧光素组合、特定仪器条件设置有关。当补偿设定之后，如果PMT的电压改变、激光波长变动、滤光片系统等有变化，荧光补偿值就会有改变，需要重新调整补偿。 |
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