癌症疫苗【二】

还有什么可以作为“癌症疫苗”？

肿瘤消融

一些肿瘤消融技术可以去除或大或小的肿块，而这个过程可以同时消弱全身和瘤内的抑制性环境。消除或减少肿瘤体积可以减少一系列由抑制因素所引起的肿瘤，同时使濒死肿瘤细胞释放肿瘤抗原。

射频消融术

这种局部加热技术能引起坏死炎症反应，并且能够暂时重建识别TAA甲胎蛋白的循环性抗肿瘤效应细胞。虽然这些记忆细胞有一定的作用，但是单独应用并不能取得显著的临床疗效。一项肝癌患者的大样本研究发现，射频消融增强了记忆细胞的应答反应，同时还产生了针对多个肿瘤相关抗原的新效应细胞。这种免疫应答与预防肿瘤复发正相关，与MDSCs数量负相关。射频消融术还能提高自然杀伤细胞活性。

高强度聚焦超声

有学者正在研究高强度聚焦超声单独应用或与其他治疗联合应用对免疫反应的激发作用。初步结果显示高强度聚焦超声能够影响STAT5(信号传导及转录活化因子5)信号通路、增加细胞毒性T细胞的效应，并改变组织结构。肿瘤栓塞(治疗性血管封锁)也能够重建循环性TAA特异性CD4＋T细胞。临床疗效与这些T细胞的出现频次和功能相关。

冷冻消融

肿瘤的冷冻消融技术也可使机体释放TAAs，从而激活抗肿瘤免疫反应。

化疗

过去10年对于小鼠模型的研究显示，不同类型的化疗药在诱导肿瘤细胞死亡的机制上有很大区别(例如有的是坏死，有的是凋亡)。具体的诱导死亡信号分子也对免疫力有影响。肿瘤细胞表面的钙网蛋白上调，机体释放的ATP、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)和肿瘤抗原都能诱发'免疫原性'死亡。传统上认为化疗会使白细胞减少，易造成免疫抑制。然而，白细胞损失的同时，循环调节性T细胞(Tregs)和MDSCs的数量也会减少，并且肿瘤细胞分泌的免疫抑制细胞因子和生长因子也会减少。而且化疗还能释放能被内源性APC摄取的肿瘤抗原，并减少肿瘤负荷。某些化疗药物联合免疫治疗对于抗肿瘤免疫具有协同作用。笔者总结了近期该领域的临床试验。

放射治疗

放疗通过使基因组DNA损伤诱导被照射组织的细胞死亡。此外，放疗不仅可引起照射部位的肿块缩小，也可造成未照射部位的组织损伤，这种现象被称为'远端效应'。该效应证实是由免疫系统介导的。最近有一项临床病例报告显示，在机体具有广泛的免疫监视情况下，放疗诱导的远端效应不仅能够诱导机体产生大量针对TAA的抗体，而且还具有强大的T细胞活化效应。在小鼠模型的动物实验中，同样显示放疗能够诱导肿瘤反应性T细胞的活化。笔者回顾了最近放疗的免疫效应的相关文章。

靶向治疗

结合信号转导分子活性位点的小分子物质的出现是癌症治疗的一项重大突破，这些信号转导分子能够驱动和阻碍肿瘤细胞的增殖。然而，许多小分子靶向药物的特异性不高，也可作用于正常组织和其他的信号通路，并且它们还可导致代偿性的突变，这些都限制其临床疗效的稳定性。

靶向治疗同样具有免疫效应。BRAF抑制剂威罗菲尼增加了黑素瘤患者肿瘤细胞TAA的表达，从而增强了机体对肿瘤细胞的免疫识别能力。有一项研究中黑色素瘤患者接受BRAF抑制剂加或不加促分裂原活化蛋白激酶(MEK)，取患者组织活检发现TAA的表达增加，而且具有更多的CD8＋ T淋巴细胞浸润，同时还观察到了细胞表明的免疫抑制标记物减少。最近小鼠模型的动物实验发现接受过BRAF抑制剂处理的小鼠肿瘤组织中有更多的肿瘤特异性T细胞浸润。

优化癌症疫苗的策略

癌症疫苗在临床试验中显示的疗效有限。虽然许多试验显示有一部分晚期癌症患者有很好的临床疗效，但是很少有试验能够获得5%～10%的部分缓解(PR)或完全缓解(CR)。有一个原因是大量的平台还处在研发中。有一些是目前已有的异体的、合成的多肽、蛋白质或病原体疫苗。还有一些是自体肿瘤细胞疫苗或APC疫苗，这些疫苗有着诱人的前景。

嵌合抗原受体(CAR)疗法(见术语表)的发展就是癌症疫苗优化策略的一个很好的例子。CAR疗法已经发展到了第三代，从CD3ζ链，经历了增加CD28或4-1BB区域，到后来的应用CD27、CD28、ICOS、4-1BB和OX40多信号结构域构建体。电穿孔转染以及重组逆转录病毒载体转染、慢病毒载体转染都是比较常用的转染方法。CAR疗法的概念一提出，就有人利用免疫耗竭方法和细胞因子支持策略来产生负载CAR的永久细胞。CAR疗法的成功是基于几十年艰苦细致的工作，由一批敬业的研究者组成的许多研究小组坚持不懈的工作确定其结构、调控中心、作用机制、靶器官，以及能够增加CAR负载细胞的联合治疗。同样地，'癌症疫苗'领域尚需要继续完善多疫苗平台技术水平来提高其临床疗效。

动物模型并不总是能够预测临床疗效

最近的一些评论讨论了动物模型的角色地位，以及我们对于遗传工程设计的基因突变动物模型的需求。这些突变的小鼠能够自发的形成肿瘤(包括人类所有的肿瘤)并发生远处转移。皮下植入体外培养的肿瘤在一些短期的简单的动物实验中显示了一定的免疫反应性，但是其中许多在临床上并未获得显著的疗效。

例如，DNA疫苗在小鼠模型和人体研究中的疗效迥异。这种简单、安全、廉价的方式在几例小鼠模型中均表现出强效的免疫原性和令人称奇的治疗效果。在小鼠中，一部分疗效与细菌来源的质粒骨干CpG二核苷酸有关，而且能够表达TLR9的髓细胞和浆细胞样树突细胞。同样的方法在人体中测试时，单独的注射DNA大多无效而且几乎没有免疫原性。随后的研究添加了更有效的佐剂；改进了的给药途径，包括体内注射；以及用DNA启动紧接着用病毒疫苗增强和维持的prime boost策略。这些研究结果取得了可喜的成果。

✎研究存在的问题

最近有学者开展了一些关于癌症疫苗能够阻止癌前病变向癌症进展的研究。那么，他们是否应该利用多种癌症疫苗平台进行更加深入的研究？

免疫生物标志物对于提供免疫应答标准化的基准、监测免疫抑制水平以及预测临床结局的预后标志物都是至关重要的。那么，临床研究中是否也应该强调这些因素呢，尤其是对于血液和肿瘤标本的研究？

基于患者特异性细胞的疫苗，以及基于肿瘤细胞、多肽表位的自体的、个体化的治疗策略具有强大的免疫潜能，能够激活肿瘤特异性和高亲和力T细胞的免疫反应。那么，我们是否应该优先考虑使用这种策略呢？

争    议

2004年，一项引人注目的综述总结了许多癌症疫苗的临床试验，最终得出癌症疫苗最低有效率为3.8%(有效率最高的是树突状细胞疫苗，为7.1%)。该文章还指出，癌症疫苗(包括树突状细胞)的影响因素仍待进一步检测，用于鉴别适应人群和最佳疫苗的生物标志物亦待进一步验证。

另一篇文章讨论了在免疫治疗的抗原靶向性问题中存在的争议。如上所述，现在运用的绝大多数抗原是在肿瘤组织中过度表达的非突变共有型抗原。该文章探讨了一些意外的不良事件、严重毒性反应，以及负载有T细胞受体或非突变自身抗原的特异性CARS的过继性高亲和力淋巴细胞致死事件。本文作者重点探讨病毒抗原，例如HPV抗原(与宫颈癌以及头、颈部癌症密切相关)、EB病毒抗原(与鼻咽癌和淋巴瘤相关)、基因突变所产生的抗原(HLA-A2＋患者中的KRAS突变)，以及类似于CD19的抗原。最终要能够使正常细胞的毒副反应完全消失，癌症细胞在一个安全或者可接受的毒性水平。

目前的技术和小鼠模型都不能完全模拟这些靶抗原的生物性能，也不能完全预测正常组织中产生毒副作用的因素，包括抗原表达水平、T细胞受体或CARS的表达水平，以及同源抗原的交叉反应性。共有抗原可能是'安全'的靶点，因为癌症疫苗会自然地主动或被动地选择内源性T细胞族群。但是，当输入大量的过继性具有高亲和力的T细胞时，或长期甚至永久消除了能够表达靶抗原的细胞时，共有抗原也会变得不安全。利用CAR T细胞在一个可接受的水平清除CD19＋B细胞群的毒性反应。

临床试验免疫监测的经验教训

虽然许多癌症治疗手段的机制尚不完全明确，但却成功地应用了几十年。其中有一些机制已经明确，这对于患者分类、分层、判断预后，以及选择最佳的联合治疗方案都是非常重要的。

如果不考虑平台的变化，那么所有癌症疫苗的主要作用机制都是相同的，即活化肿瘤特异性T细胞。现在癌症疫苗已经克服了可行性、安全性、免疫原性、生物活性和疗效等方面的障碍(尽管是在一小部分患者当中)。那么关键的问题则在于：

什么因素导致了疫苗活化T细胞治疗失败？

怎么样制备和输注疫苗才能有效地激活抗肿瘤的T细胞？

哪些患者最有可能对癌症疫苗有效？

对癌症疫苗来说，预防是最好的临床结局吗？

要回答这些问题，我们需要对免疫监视和疫苗进行详细的分析(图3)。癌症免疫治疗协会与NCI和FDA一道成立了一个工作小组专门负责调研这些问题，并作出相应的建议。这份报告更新了协会以前的研究成果，吸取了许多重要的建议包括有来自全球免疫监测方面的知名专家以及他们的研究成果。

图3 肿瘤疫苗免疫反应的监测方法。总结对患者标本的处理和免疫监测分析。我们可以将肿瘤标本冰冻或者石蜡包埋切片进行免疫组化(ICH)分析。也可以通过酶消化处理后制成单细胞悬液。血标本可以通过密度梯度离心分离(Ficoll-Paque)，然后进行其他各种检测；TILs＝肿瘤浸润淋巴细胞

具体而言，为了明确抗肿瘤T细胞的关键生物学特性，我们不仅需要评估反应率和肿瘤反应性T细胞的表型，还需要评估机体产生的细胞因子、效应分子和趋化因子。多项试验都显示，免疫性TAA表位产生的多肽特异性CD8＋T细胞在血液循环中大量存在，但这与临床疗效并无显著的相关性。这可能是成功接种疫苗之后的表现。

当疫苗中含有多个抗原的多肽时便会产生意想不到的效果。在一些试验中观察到，这些复合多肽的反应广度与临床疗效具有相关性。过去10年里涌现出越来越多的设计完美、操作严格的临床试验，并且对CD8＋和CD4＋T细胞、自然杀伤细胞和抗体反应性等多方面进行了评估。

证实免疫措施与临床结局相关的例子

有一个研究给一位外阴上皮内瘤变患者接种来自HPV-16的长肽结果证实，免疫措施与临床结局之间具有相关性。研究者检测到淋巴细胞的增殖，以及促进免疫性抗原和Tregs产生的细胞因子。治疗有效的患者表现为淋巴细胞增殖、最高水平的干扰素γ和IL-5，以及最低水平的Tregs。

有一个试验给予急性髓系白血病患者接种TAA WT-1的疫苗，结果发现治疗有效的患者中WT-1特异性CD8＋T细胞数量显著增加，而且活化了更多的循环自然杀伤细胞。

另一个在黑色素瘤患者中开展的大型多中心临床疫苗试验的结果显示，复合多肽疫苗表位的免疫性与临床结局具有相关性。该试验采用两种测量方法来测定特异性免疫：MHC四聚体流式细胞仪测定疫苗抗原特异性T细胞的数量；ELISPOT(酶联免疫斑点法)测定外周血单个核细胞释放的干扰素γ的数量。结果显示，酶联免疫斑点法检测结果与总生存率相关，然而MHC表型四聚体检测结果却与临床疗效无关，即使有疫苗特异性T细胞的数量增加。

在一项应用复合多肽疫苗治疗肾癌患者的试验中发现，抑制Tregs能够增强抗肿瘤免疫。MDSCs在基线上的特定亚群数量至关重要，而且临床疗效与应答的多肽数量有关。

预后标志物

其他潜在的预后标记物包括外围血细胞分泌的细胞因子、裂解颗粒和趋化因子，我们将其称之为'polyfunctionality'。

另一个重要参数是肿瘤中免疫细胞的浸润。在黑素瘤患者中，淋巴细胞浸润的速度和强度与患者预后密切相关。最近发现，化疗前结直肠癌患者中出现T细胞浸润是预后良好的一个重要标志物。尽管抗原特异性并不清楚，但是浸润的细胞多是CD3＋/CD8＋/CD45R0＋的细胞，也可能是所有这些细胞全部浸润肿瘤组织。

通过组织分析和分子水平处理替代免疫组化的方法，鉴别出了黑素瘤患者的预后标志物，包括1型干扰素。

患者的特异性因素

影响患者抗肿瘤反应的因素表现在几个水平上。对基线肿瘤特异性T细胞的分析可以识别出那些能够促进现有免疫反应的患者。对基线循环抑制细胞的分析能够鉴别出那些由于过多的Tregs和MDSCs而不太可能出现反应的患者，以及那些应用联合治疗策略能够削弱免疫抑制的患者。

我们对血浆或血清中的大量细胞因子进行检测，结果表明同样具有免疫偏移(偏移向了2型免疫调节或抑制反应，涉及有IL-4、IL-5、IL-13和其他不支持毒性CD8＋T细胞的分子)，并且表明需要阻断或者增强细胞因子才能取得最佳疗效。对患者特异的小核苷酸多态性的遗传分析可以识别那些改变了基因表达模式的亚群。

最后，如上所述，肿瘤组织已经浸润或发炎的患者，如果想获得持续的免疫应答，需要加入增强剂或检查点阻断剂(抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体；见术语表)，检查点阻断剂能够使免疫细胞扩增或解除免疫阻遏。与此相反，肿瘤组织未被浸润的患者则是接种疫苗来激发抗肿瘤免疫反应的最佳人群。

笔者回顾了近期各种检测这些不同免疫参数的方法。

新兴疗法：癌症疫苗组合

如上所述，一些最新的和相对成功的疫苗策略都包括有疫苗联合应用策略以及疫苗联合标准治疗的策略。在小鼠模型研究的基础上，有研究将针对不同TLRs的几种佐剂混合物与疫苗联合应用，并展现出很好的前景。

'Prime-boost'疫苗从根生上来说也是一种联合疫苗。癌症疫苗的目的是为了提高患者过继性T细胞(提呈最佳的肿瘤抗原)的存活时间和功能。这些疫苗都是从小鼠模型的动物实验开始研究，现在已经进入了临床试验阶段。

由于许多抗原已被证明具有免疫原性而且是安全的，因此复合抗原的使用也变得更加普遍。在应用疫苗后，有研究正在探讨消除肿瘤的许多治疗手段是否引起了免疫抑制性Tregs和MDSCs的增加。

最后，癌症疫苗与检查点阻断剂(抗-CTLA-4抗体，抗PD-1抗体)的联合应用将是今后研究的趋势(图4)。因为免疫系统具有自我调节作用，活化的T细胞能够上调CTLA-4的PD-1，机体还能激活抑制T细胞活性的其他细胞表面分子。单独应用抗CTLA-4抗体结合抗PD-1抗体已经显示出显著的临床疗效，如果将这些抗体和癌症疫苗联合应用将进一步增加每一种疫苗的抗肿瘤反应。

图4 癌症疫苗可与其他各种治疗相结合比如标准治疗、检查点(checkpoint)阻断、免疫治疗以及消弱免疫抑制的治疗。CTLA-4＝细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4；GM-CSF＝粒-巨噬细胞集落刺激因子；IFN＝干扰素；IL-2＝白介素2 ；MDSC＝髓源性抑制细胞；PD-1/L1＝程序性死亡分子1/配体1；Tregs＝循环调节性T细胞

结论

癌症疫苗的领域涵盖了一系列能够促进肿瘤特异性免疫应答的策略。我们已经证实了TAAs的安全性和免疫原性，而且一些临床试验显示基于TAAs的疫苗能够产生客观的临床反应。为了提高免疫应答，一些新的临床试验正在开展关于复合抗原、患者特异性突变抗原、病毒载体、prime-boost策略，以及联合标准治疗的策略的相关研究。

Thanks to Robert Vonderheide (University of Pennsylvania) for helpful discussions.

关于作者(Contributors): As sole author I accept responsibility for all aspects of this review and act as guarantor.

资助(Funding): LHB is supported by NIH/NCI RO1 CA138635, NIH P50 CA121973, and NIH P30 CA047904.

利益竞争(Competing interests): I have read and understood BMJ policy on declaration of interests and have none to declare.

来源与同行评议(Provenance and peer review): Commissioned; externally peer reviewed.

BMJ 2015; 350 doi: http://dx./10.1136/bmj.h988