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作者 l 喋喋喋喋 编辑 l 细胞房间 肿瘤，患者人群庞大，发病机制复杂，死亡率仅低于心血管疾病，是威胁人类健康的杀手之一，令人闻之色变。目前全球抗肿瘤药物市场正在大步迈入精准医疗时代，免疫治疗靶向药物已成为抗肿瘤药物市场的重中之重。免疫检查点抑制剂与CAR-T疗法的研究成果百花齐放，而肿瘤疫苗领域似乎成果平平，仅有少数重磅产品问世。 肿瘤疫苗是将肿瘤抗原以多种形式导入患者体内，通过肿瘤抗原刺激患者体内T细胞，激活患者自身特异性细胞免疫的治疗方法。具有疗效高、特异性强、不良反应较小等优点，具有重要临床价值。 根据功效不同，肿瘤疫苗可分为预防性疫苗与治疗性疫苗两类：预防性疫苗可预防健康人群内肿瘤的发生，目前市场上两类预防性肿瘤疫苗，包括人乳头瘤病毒（HPV）疫苗和乙型肝炎病毒（HBV）疫苗；治疗性肿瘤疫苗多用于肿瘤治疗，又可与手术、放疗、化疗等相结合用于肿瘤的辅助治疗。 疫苗产品的开发过程中需要考虑许多复杂的因素，包括肿瘤抗原（tumor-antigen）、制剂类型（formulation）、佐剂（adjuvant）与输送方法（delivery）的选择。本文将基于疫苗产品开发的重要因素，重点关注治疗性疫苗的基本情况，介绍肿瘤疫苗的发展史、肿瘤抗原的选择与个性化疫苗的开发、不同制剂类型疫苗产品的特点及临床进展，佐剂与运输系统的介绍以及联合治疗的临床情况。
肿瘤疫苗的发展史 早在1893年，癌症免疫治疗之父William B. Coley就发现化脓性链球菌所分泌的丹毒毒素能够引起肉瘤晚期患者的肿瘤消退。牛痘病毒感染的灭活肿瘤细胞混合卡介苗（BCG Vaccine）对结直肠癌患者显示出小部分临床获益。由于当时人们缺乏对肿瘤抗原的认识，肿瘤疫苗的发展经历了将近一个世纪的沉寂。1970-1980这十年间，致癌基因如RAS，抑癌基因如TP53，突变致癌基因如BCR-Abl1被研究者们发现。1973年，科学家们发现并证实树突状细胞（dendritic cells，DCs）具备抗原呈递潜能，至此揭开了对DC细胞免疫机制及DC疫苗研究的序幕。20世纪90年代是肿瘤相关抗原（tumor-associated antigen，TAAs）发现的黄金年代，1991年通过对肿瘤cDNA表达文库筛选的肿瘤特异性T细胞克隆，研究者发现了第一个人类肿瘤抗原：黑色素瘤相关抗原1（MAGE1），紧接着基于MUC1、MAGEA3及HER2等一系列肿瘤抗原的多肽疫苗开始投入临床。与肿瘤抗原发现工作同时展开的，还有研究者对打破肿瘤抗原的免疫耐受性并改善抗原呈递做出的努力。伴随对DC疫苗的研究，经遗传修饰获得分泌粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）表达的DNA疫苗问世，它能够有效调动CD4/8+T细胞，促进其对肿瘤的杀伤。2000年前后，研究者们开始尝试利用TAAs激活免疫系统，以基因修饰肿瘤细胞为基础的肿瘤疫苗开始真正应用于临床，同时基于病毒、细菌与病毒样颗粒物质被用于TAAs的呈递，多肽疫苗、DNA与RNA疫苗进一步进入人们视线。对人乳头瘤病毒（HPV）引起的阴道上皮内瘤患者接种HPV-16毒蛋白合成的长肽，表现出可观的临床应答。 2010年，以自体DC细胞为基础的前列腺癌疫苗Sipuleucel-T（Provenge，普列威）成为人类第一个获得美国食品药品管理局（FDA）批准的肿瘤疫苗。目前依然有多项针对肿瘤相关抗原的疫苗的临床研究正在开展，例如2012年用于肾细胞癌的多肽疫苗IMA901与2015年开发的G-VAX胰腺癌疫苗。基于多价新抗原的疫苗均在临床前实验中显示出明确的抗肿瘤活性，目前正处在人体临床试验早期阶段。 图1-肿瘤抗原与肿瘤疫苗的发展史[1]
肿瘤抗原的选择伴随个性化肿瘤疫苗的诞生 我们讨论肿瘤抗原的选择，更多的是对诸多肿瘤相关抗原（tumor-associated antigens，TAAs）与肿瘤特异性抗原（tumor-specific antigens，TSAs）的权衡比较。TAAs是未突变基因表达的抗原蛋白，机体正常细胞中有少量表达，但在肿瘤细胞中过表达。例如，端粒逆转录酶TERT、乳腺癌与胃癌高表达的HER2、前列腺癌高表达的PSA、黑色素瘤高表达的MART1及抗凋亡蛋白Survivin等都是TAAs。理论上，病人对这类抗原已存在对应的中枢免疫耐受，且由于正常组织也表达该类抗原，被触发的免疫反应可能对正常组织造成“误伤”。临床试验方面，默克公司的Stimuvax（靶向MUC1，2013年更名为tecemotide）III期研究两度宣告失败，葛兰素史克公司的GSK1572932A（靶向MAGEA3）也止步于临床III期，由此提示我们，TAAs并非理想的抗原。 伴随科学家们的不断探索，肿瘤特异性抗原TSAs逐渐成为研发热点。TSAs是由肿瘤细胞DNA突变产生的新抗原（neo-antigens）。仅肿瘤细胞表达TSAs，能够有效激发强免疫反应，又避免损伤正常细胞。因此，基于下一代测序技术（NGS），构建相应算法模型，结合外显子测序与转录组测序，分析肿瘤DNA与RNA表征，帮助我们准确找出被免疫细胞识别的肿瘤突变；通过新型生物信息学技术，基因组大数据与计算机算法准确预测肿瘤表位与MHC蛋白的亲和能力，基于neo-antigens的精准免疫治疗技术不断升温[2]。与此同时，基于TSAs研发策略的个性化肿瘤疫苗在临床试验方面结果喜人。Catherine Wu研究团队为6位黑色素瘤患者制作了辅以佐剂poly-ICLC的多肽（15-30 aa）个性化肿瘤疫苗，结果显示这6位患者中，4人在32个月内无复发，另两位肺转移患者复发后接受anti-PD-1辅助治疗后获得完全缓解（NCT01970358）[3]。Ugur Sahin研究团队为13名黑色素瘤患者制定个性化治疗方案，患者首先接受NY-ESO-1或tyrosinase疫苗，之后输入个性化RNA疫苗。结果显示这13位患者中，8位患者在23个月内无复发；其余5位患者在肿瘤扩散后接种疫苗，2人肿瘤缩小，1人接受anti-PD-1辅助治疗后完全缓解（NCT02035956）[4]。Janos L. Tanyi研究团队则首次采用氧化自体全肿瘤细胞裂解物（OCDC）形成的自体树突状细胞治疗晚期卵巢癌，结果显示在25名卵巢癌患者中，11人产生了特异性应答，两年内总生存率达100% [5] 。Wistar研究所在高通量分析MAGE-A家族12种蛋白表达水平的基础上，通过合并多个来自MAGE-A家族的一级序列开发了同时靶向7个TSAs的新型DNA疫苗。该新型疫苗抑制了黑色素瘤小鼠肿瘤生长，显著延长了小鼠生存时间[6]。 以上研究对于neo-antigens的研发策略相似：在对肿瘤与对照组的组织样品进行基因组测序的基础上，找到引起蛋白表达变化的体细胞突变，通过对肿瘤组织高通量RNA测序，分析突变基因的表达情况，结合患者人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）分型信息，筛选出与患者个体HLA具有强亲和力的多肽[1]。然而个性化肿瘤疫苗设计除需要考虑neo-antigens的选择外，仍有许多需要考虑的因素：活检本身存在风险，且活检获得的肿瘤样本是否具有代表性；DNA序列设计的准确性是否有保证，且后期转录、翻译与修饰是否会引入突变也需要进一步考察确认。
不同制剂类型疫苗产品基本情况 根据来源及构建载体的不同，肿瘤疫苗可划分为肿瘤抗原肽段、基因修饰多肽疫苗、质粒DNA 疫苗、病毒及细菌载体疫苗、树突状细胞（dendritic cell， DC）疫苗等。 1）肿瘤多肽疫苗 由TAAs、TSAs、癌基因或抑癌基因突变蛋白及多肽所组成的疫苗目前归类为肿瘤多肽疫苗。T细胞主要通过识别与主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）分子结合呈递的抗原多肽。人工合成多肽能够直接与MHC I类分子相结合，不需要抗原呈递细胞（Antigen-presentingcells，APC）的加工处理。肿瘤多肽疫苗大多是由肿瘤细胞裂解或人工合成的肿瘤抗原肽段，单独或辅以佐剂用于肿瘤患者，肿瘤抗原肽段进入体内，直接诱导体内细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）的应答，激发机体的特异性肿瘤免疫反应。 数据来自：ClinicalTrials 2）核酸疫苗 核酸疫苗多指DNA疫苗，将编码某种肿瘤抗原的外源基因克隆到真核表达载体上，将重组的质粒DNA导入宿主体内，使外源基因表达于宿主，产生相应抗原物质，诱导特异性细胞免疫与体液免疫应答，激活机体的免疫系统。DNA疫苗在体内涉及的免疫反应主要包括三种机制：直接转染体细胞（肌细胞或角质细胞）、直接转染APC和交叉激活。大量研究表明，多种类型的抗肿瘤DNA均具有一定抗肿瘤作用，其中包括根据病毒抗原构建的DNA疫苗（仅针对病毒源性肿瘤，应用较受限）、根据癌胚抗原（carcino-embryonicantigen，CEA）构建的DNA疫苗（针对高表达CEA的结直肠癌、乳腺癌和非小细胞肺癌等，具有相对广谱性）、根据肿瘤共同抗原构建的DNA疫苗（NY-ES-O1和MAGE-1等靶点）、根据肿瘤组织特异性抗原肽构建的DNA疫苗（gp75/TRP、gp100/pmedl17、melan-A/MART等只与黑色素瘤相关抗原）、癌基因与抑癌基因DNA疫苗（基于ras、bcr-abl、HER-2/neu、p53等）、编码细胞因子基因的DNA疫苗（IL-12、GM-CSF、IL-15等，近年来已较少采用，更多作为DNA疫苗佐剂），另外还有CTL表位DNA疫苗、异种同源基因DNA疫苗、抑制血管生成DNA疫苗、促肿瘤细胞凋亡DNA疫苗及多价DNA疫苗等。 数据来自：ClinicalTrials 3）病毒、细菌载体疫苗 利用病毒与细菌的高拷贝特性，将肿瘤抗原基因插入细菌或病毒的基因组或质粒DNA，使其高效表达，输送至患者体内模拟病原体的自然感染，刺激机体产生高效持久的体液免疫和细胞免疫，发挥抗肿瘤作用。此类疫苗主要分为两种类型，一种为靶向与病毒感染密切相关的肿瘤（对应的肿瘤病毒包括与鼻咽癌、胃癌、淋巴瘤相关的EBV病毒和与宫颈癌、肛管癌相关的HPV病毒），另一种为重组的病毒疫苗，即将目的基因转入病毒载体而获得。常用的病毒载体包括腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒等，而腺病毒载体疫苗以其安全性强，滴度高的特点被广泛使用。 数据来自：ClinicalTrials 4）树突状细胞（DC）疫苗 树突状细胞（dendritic cell，DC）负责体内主要的抗原呈递，具有活化静息T细胞作用，主要参与细胞免疫反应和T细胞依赖的体液免疫过程。DC细胞治疗主要通过分离患者自体的前DC细胞（单核细胞），通过体外诱导培养成DC细胞，负载肿瘤抗原后将其回输入患者体内，刺激特异性肿瘤T细胞增殖，发挥长期肿瘤监视和肿瘤杀伤作用。前文提到的全球首款治疗性肿瘤疫苗Provenge就是一种DC疫苗。研究思路即DC细胞吞噬肿瘤相关抗原，通过胞内处理将小分子肽呈现在细胞表面形成人白血球抗原MHC II，CD8+的T细胞通过识别MHC II，杀死肿瘤细胞。截至目前大部分DC疫苗的研发关键，除肿瘤相关抗原的制备方式（如多肽、重组蛋白，基因工程修饰的肿瘤细胞，病毒或细菌载体表达的肿瘤抗原，肿瘤抗原DNA或RNA）与DC细胞来源（如体内的，分离提纯的或者分离外周血白细胞的）需要关注外，佐剂与免疫刺激剂的选择（如羧甲基纤维素，聚肌胞苷酸，多聚赖胺酸双股RNA等）也需要纳入考虑。 数据来自：ClinicalTrials 5）不同剂型肿瘤疫苗优、缺点汇总 不同剂型优势与缺陷[7] 佐剂与运输 佐剂，又称为免疫增强剂，与抗原混合输入患者体内能够增强机体对抗原的特异性免疫应答。佐剂的主要作用包括： 1）增强抗原免疫原性、免疫应答速度与耐受性； 2）降低抗原用量及抗原免疫保护接种剂量； 3）增加细胞渗入性，防止抗原降解，辅助抗原运输到抗原呈递细胞，诱导细胞因子的释放。 根据化学成分，疫苗佐剂可分为铝盐佐剂、蛋白类佐剂、核酸类佐剂、含脂类佐剂、混合佐剂和聚集体结构佐剂等。目前最常用的佐剂为GM-CSF，肿瘤疫苗GVAX更是将GM-CSF表达修饰的肿瘤细胞，经射线处理杀死后回输入患者，诱发相应的细胞免疫反应。除此以外，伴侣蛋白、Toll样受体及PAMP受体等也已进入临床阶段[8]。 肿瘤疫苗+免疫检查点抑制剂，双剑合璧能否再下一城？ 目前，免疫检查点抑制剂（Checkpoint Inhibitors，CPIs）已成为抗肿瘤市场中最“吸金”的领域之一。诸多研究资料表明，肿瘤疫苗联合免疫检查点抑制剂，能够持续激活杀伤T细胞，促进免疫系统有效的特异性杀伤，增强体内免疫反应，进而起到事半功倍的功效。 据临床数据显示（NCT02506114），Prostvac联合ipilimumab治疗去势耐受的转移性前列腺癌，联用组与仅接受ipilimumab治疗的患者相比，总生存期显著延长（37.2个月vs 26.6个月）。 部分在研肿瘤疫苗联合CPI临床试验，数据来自：ClinicalTrials 除与免疫检查点抑制剂联用外，肿瘤疫苗联合放疗、化疗、小分子靶向药物、激素治疗等肿瘤治疗手段，能够显著增强体内免疫反应，获得较佳治疗效果。化疗药物大多具有细胞毒性，低剂量的化疗药物诱导肿瘤细胞对效应T细胞作用更加敏感，从而减少化疗药物剂量以保证患者的生存质量。小鼠模型数据显示，肿瘤疫苗CEA-TRICOM联合多靶点TKI抑制剂Sunitinib能够有效抑制肿瘤内部血管生成，与单独使用Sunitinib只抑制肿瘤外周血管生成形成鲜明对比。小分子抑制剂与肿瘤疫苗联用，能有效减小肿瘤体积，帮助效应T细胞向肿瘤微环境转移。对于激素治疗可以缓解的内分泌相关肿瘤（乳腺癌和前列腺癌），肿瘤疫苗与之联用能够减少微环境中的恶性肿瘤细胞，形成免疫刺激环境[9]。 总结： 当今的抗肿瘤药物领域，以PD-1与CAR-T为首的肿瘤免疫疗法各占半壁江山。以抗PD-1/PD-L1及抗CTLA-4为代表的免疫检查点抑制剂产品依旧保持热度备受追捧，Kymriah与Yescarta接连获FDA批准上市炙手可热。但我们无法忽略，这两种疗法针对实体瘤的应答率与疗效不够理想。同时治疗性肿瘤疫苗虽显示出在实体瘤中部分的治疗效果，但受制于多方因素，早期开发成功率不高。在现有免疫治疗产业基础上，更应该着眼于对新抗原的精准免疫治疗应用，希望伴随着基础研究工作的不断开展、新技术的不断更新以及不断积累的临床数据，开启肿瘤疫苗研究的新篇章，为帮助人类更有力的对抗癌症病魔贡献力量。 参考文献： 1. Hu, Zhuting, Patrick A. Ott, and Catherine J. Wu. Towards personalized, tumour-specific, therapeutic vaccines for cancer. Nature Reviews Immunology 18.3 (2018): 168. 2. Banchereau, Jacques, and Karolina Palucka. Immunotherapy: Cancer vaccines on the move. Nature Reviews Clinical Oncology 15.1 (2018): 9. 3. An immunogenic personal neoantigen vaccine forpatients with melanoma. Nature, 2017, 547(7662): 217-221. 4. Ott, Patrick A., et al. An immunogenic personal neoantigen vaccine for patients with melanoma. Nature 547.7662 (2017): 217. 5. Tanyi, Janos L., et al. Personalized cancer vaccine effectively mobilizes antitumor T cell immunity in ovarian cancer. Science translational medicine 10.436 (2018): eaao5931. 6. Duperret, Elizabeth K., et al. A designer cross-reactive DNA immunotherapeutic vaccine that targets multiple MAGE-A family members simultaneously for cancer therapy. Clinical Cancer Research (2018). 7. Sahin, Ugur, and Özlem Türeci. Personalized vaccines for cancer immunotherapy. Science 359.6382 (2018): 1355-1360. 8. Kudrin, Alex. Cancer vaccines: What do we need to measure in clinical trials?. Human vaccines & immunotherapeutics10.11 (2014): 3236-3240. 9. Gatti-Mays, Margaret E., et al. Cancer vaccines: Enhanced immunogenic modulation through therapeutic combinations. Human vaccines & immunotherapeutics 13.11 (2017): 2561-2574. |
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