|
转载请注明：解螺旋·临床医生科研成长平台 在5月14日的推送中，我们详细介绍了研究RNA与蛋白质互作的实验——RNA pull down，然而，要想研究长非编码RNA通过与蛋白质结合发挥功能，仅仅通过RNA pulldown技术鉴定到有关蛋白，是远远不够的，还需要研究的问题是： 1长非编码RNA如何与该蛋白结合？ 2.长非编码RNA与蛋白结合后影响了蛋白的哪些功能？ 今天要和大家分享的是4月9日发表在CANCER CELL上的研究：“lncRNA Epigenetic Landscape Analysis Identifies EPIC1 asan Oncogenic lncRNA that Interacts with MYC and Promotes Cell-Cycle Progression in Cancer”。 Cell系列杂志的特点之一就是图特别多，实验特别详细，对初接触该领域的学者来说可能并不是很友好，但其实cell的研究实验论证非常严谨，为证明同一个问题，往往会设置齐全的对照，以及使用多种实验手段进行验证，因此，看懂读透其中的实验设计对今后的课题开展将大有帮助。 下面依然采用三步法为大家做文献解读。 选中一个lncRNA 通过对RNA-seq的分析找到表达差异最明显的长非，已是大家熟悉的套路，如果想从第一步就做得新颖有趣，不妨试试将其他类型的测序数据与RNA-seq的数据进行联合分析。比如今天要分享的这篇文章，研究者对lncRNA的基因甲基化水平做了全面的分析，发现一个非常有趣的现象。在许多癌症中，蛋白编码基因的启动子区CPG岛都具有较高的甲基化修饰，然而长非编码RNA却没有这样的现象。长非编码RNA的DNA甲基化水平可高可低。（下图） 研究者将DNA甲基化的数据与RNA-seq的数据结合，鉴定了一系列由于DNA甲基化改变而发生表达量变化的长非编码RNA。其中，EPIC1的表达量最高，并且与预后相关，引起了研究者的注意。 做表型 研究者在乳腺癌细胞系中，利用siRNA技术敲低了EPIC1，做了克隆形成，细胞增殖，细胞周期以及小鼠实验，发现敲低EPIC1可以抑制肿瘤的生长，说明EPIC1在乳腺癌中发挥癌基因的作用。 搞机制 那么，EPIC1是如何促进癌症的发生发展的呢？研究者并没有直接通过RNA pulldown技术来寻找与EPIC1互作的蛋白质，而是对敲低EPIC1的细胞系进行了测序，通过RNA-seq的聚类分析，发现MYC的下游基因发生了显著的变化，并且qPCR也验证了这一点。 那么，EPIC1是否通过与MYC结合，影响MYC的功能呢？此时，研究者利用RNA pulldown技术做了验证，发现EPIC1确是与MYC结合。 接下来，就是今天主要和大家分享的内容——长非编码RNA与蛋白结合后，是如何影响蛋白功能的。 要回答这个问题，首先要解析EPIC1是如何与MYC结合的。通过对EPIC1和MYC的分段克隆和RNA pulldown，研究者发现EPIC1主要通过它的129-283nt的序列与MYC的148-220氨基酸序列结合。这个实验结果看上去很炫，能将研究拉上一个档次，但是实验方法和技术并不难，只是分子克隆和RNA pulldown的结合。 那么，长非影响了蛋白的什么功能呢？回答这个问题，需要结合蛋白本身的功能。MYC是一个转录因子，通过结合DNA影响基因的转录。而EPIC1可以影响MYC下游基因的表达，那么，EPIC1极有可能是影响了MYC与靶基因的结合。通过CHIP实验，研究者发现在敲低EPIC1后，MYC对靶基因的结合显著降低了。说明EPIC1通过结合MYC，促进MYC对靶基因启动子的结合。 对转录因子，可以首先考虑长非与它的结合是否影响了转录因子的活性。而长非结合的蛋白多种多样，想要知道长非影响了蛋白的什么功能，其实并没有“套路”。但是，目前已证明的长非对蛋白的作用包括以下几种，参考文献也一并列出，供大家参考。 |
|
|
